发布时间 : 星期四 文章发酵设计链霉菌生产维生素B12更新完毕开始阅读784c91d84afe04a1b071de30
中北大学2012年发酵工程课程设计说明书
5 种子扩大培养
种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种的过程。本发酵属于二级种子罐扩大培养，三级发酵。设计流程如下：
孢子——锥形瓶——种子罐——发酵罐 种子制备的工艺流程如图3所示：
图1 种子扩大培养流程图
5.1 实验室种子制备
保藏在沙土管或冷冻干燥管中的菌种经无菌手续接入合适于孢子发芽或菌丝生长的斜面培养基中，经培养成熟后挑选菌落正常的孢子可再一次接入试管斜面，对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌落可以采用固体培养基培养孢子，孢子可直接作为种子罐的种子，这样操作简单，不易污染杂菌。对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的灰色链霉菌可以用摇瓶液体培养法。孢子接入含液体培养基的摇瓶中，于摇床上恒温振荡培养，获得菌丝体，作为种子。
5.2 生产车间种子制备
将生产菌种悬浮液用微孔接种法接入种子罐进行扩大培养，种子罐之间的转
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接采用压差接种法，种子罐接入发酵罐也采用压差接种法。
种子罐级数确定的原则：
①保证种子量足够，满足生长需求。 ②尽量减少级数，简化工艺，减少污染。
种子罐培养的目的是使种子量增大，以缩短发酵罐的发酵延滞期。灰色链霉菌属于放线菌，因其生长速度较慢，产维生素Ｂ12采用三级种子罐，也称四级发酵。若取接种量为10％。三级种子罐用一个种子罐，体积为V3=100×10％=10m3。二级种子罐用一个种子罐，体积为V2=10×10％=1m3。则一级种子罐也用一个种子罐，体积为V1=1×10％=0.1m3，一级种子罐到二级种子罐采用压差接种法。种子罐的体积按照接种量来确定。
5.3 影响种子质量的因素
影响种子质量的因素有原材料的质量，培养条件（温度、湿度、通气量）和斜面冷藏时间。生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象，其主要原因是原材料质量波动。原材料质量的波动，起主要作用是其中无机离子含量不同。种子质量的控制可以通过菌种稳定性检查，无菌检查，保证原材料质量和控制培养条件等。
6 发酵过程的工艺控制
6.1 发酵过程技术原理
微生物发酵过程可分为：分批发酵、补料-分批、半连续（发酵液带放）和连续发酵。分批发酵是一种准封闭式系统。补料-分批发酵，即在分批发酵（一次性加入发酵罐内等发酵完全后放罐）的基础上，加入新鲜的料液，也克服由于养分的不足导致发酵过早结束。连续发酵是在发酵过程中一边补入新鲜的料液，一边以相近的流放速放料，维持发酵液原来的体积。本设计采用半连续发酵，即在补料-分批发酵的基础上加上间歇放掉部分发酵液，放掉部分发酵液，再补入适当料液不仅补充养分和前体而且代谢有害物被稀释，从而有利于产物的继续合
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成。
6.1.1 发酵过程中接种量的控制
接种量对发酵过程的影响很大，主要是影响菌体量，菌体的生长状态以及发酵液中溶氧状况，从而影响产酶。分别考察2%、4％、6％、8％、10％的接种量对VB12的产量、菌体干重以及溶氧的影响。实验结果得出，随着接种量的增大，菌体量增加迅速，接种量为10％时，在发酵到36h时，菌体量达到最大。但接种量过大，发酵前期菌体大量繁殖，发酵液迅速变得粘稠，导致整个发酵体系溶氧水平下降，供氧不足，从而影响产量。可见，接种量的选择对VB12的合成有着非常重要的影响，从发酵各参数考虑，选择10％的接种量较为合适。
6.2 发酵条件的影响
维生素B12的发酵生产水平取决于生产菌种的特性和发酵条件（包括培养基）的控制）。其中发酵条件包括：发酵温度、溶氧、Ph、培养基营养成分等。 6.2.1 温度对维生素B12发酵的影响
菌体的生长和合成抗生素的代谢活动都是在各种酶的催化下进行的，然而酶的催化作用需要有适当的温度。从酶反应动力学来看，随着温度的升高，酶的活性加强，反应速率加大，生长代谢加快，抗生素分泌期提前，但温度过高，则酶易失去活性，菌体易迅速衰老，发酵周期缩短，抗生素产量就降低，因此维持产生菌的生长和合成抗生素所需要的最适温度是抗生素发酵的重要条件。研究表明, 灰色链霉菌对温度敏感。一般认为维生素B12发酵温度以30℃左右为宜。 6.2.2 溶氧对维生素B12发酵的影响
维生素B12由链霉菌发酵产生，灰色链霉菌是一种高度需氧菌，维生素B12组成部分咕啉醇酰胺（B因子）生物合成前期的两种主要酶受到养的阻遏，限制养的供给，才能积累B因子，B因子在供氧的情况下，才能转变成维生素B12。发酵
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前期菌丝体大量繁殖，需氧量大于供氧，溶氧出现一个低峰。在生长阶段，产物合成期，需氧量减少，溶氧稳定，但受补料、加油等条件大影响。补糖后，摄氧率就会增加，引起溶氧浓度的下降，经过一段时间以后又逐步回升并接近原来的溶解氧浓度。如继续补糖，又会继续下降，甚至引起生产受到限制。发酵后期，由于菌体衰老，呼吸减弱，溶氧浓度上升，一旦菌体自溶，溶氧浓度会明显上升。在进行维生素B12工业化生产时，以此来确定发酵罐的通气量和搅拌功率。 6.2.3 PH对维生素B12发酵的影响
无机氮源是决定维生素B12产量的重要因素。据文献报道NH3-N能被菌体快速利用并促进菌体生长，并由此控制pH，并调节了pH在适合于维生素B12合成内，也补充了产物合成所需N的来源，维生素B12的合成最适范围为6.8～7.0,pH过高或过低，对发酵都不好，pH不适合的时候，可以用酸碱缓冲剂来调节。 6.2.4 无机盐对维生素B12发酵的影响
无机盐是菌丝生长所必需的重要元素，能促进菌丝的生长，但在维生素B12
的发酵中，过多的无机盐会形成大量无活性的维生素B12。并且在发酵罐培养时还发现，在培养基中适当增加磷酸盐，可延缓菌丝衰老、自溶，减少发酵液的泡沫，可以改善发酵液的质量，有利提取过滤。
6.3 发酵过程中周期的控制
优化后的培养基，以葡萄糖为碳源发酵生产维生素B12通过单因素试验确定的培养条件为接种量10%,种龄48h,装液量75/300 ml三角瓶,培养基初始pH 值6.8,30℃静止发酵,周期为144h, 维生素B12的产量为5.7g/l
6.3.1 发酵过程中消泡的控制
发酵过程中泡沫较大，除在基础料中加入0.1%泡敌外，还以（花生油：泡敌= 5：1）作为混合消泡剂于发酵过程中滴加控制泡沫。
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