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超滤管使用方法和注意事项
蛋白浓缩和换Buffer通常使用的超滤管，常用Millipore的Amicon-Ultra-15超滤管（MWCO10kD）。也有其它型号 的、不同体积大小和MWCO超滤管可选，视目的蛋白的分子量与浓缩前体积、浓缩目标体积而定。可重复使用，使用一次就扔掉太浪费。以下是个人总结的使用方 法和注意事项。
1、选择合适的超滤管，主要考虑MWCO和浓缩体积，最常见的是Ultra-15（10kD）。到底选择多大截留分子量比较合适呢？10kDa、 5kDa、还是30kDa？通常应截留分子量不应大于目的蛋白分子量的1/3，比如目的蛋白分子量为35kDa，就可以选择10kDa截留分子量的超滤 管。若目的蛋白分子量为10kD左右，则可以用截留分子量3kD的超滤管。认真阅读使用说明书，注意超滤膜对各种化学物质的耐受程度有所不同，表格中有。
2、新买来的超滤是干燥的，使用前加入MilliQ水，水量完全过膜，冰浴或冰箱里预冷几分钟。然后将水倒出，即可加入蛋白液，加入的多少，以不超过管顶的白线为准。操作要轻，加入蛋白液前，超滤管需要插在冰上预冷。
3、平衡。质量和重心二者都要达到平衡。注意转速和加速度不可太快，否则直接损坏超滤膜。开始离心超滤（离心机预冷至4度）。不同离心机的转速 rpm换算成g之后，有所不同。具体可参阅附件里的说明书。离心机的加速度调至最低档，减小对膜的压力。注意，一定要等离心机达到目的转速之后，方可离开 离心机，否则离心机出问题时，无法第一时间处理，后果不可预测！膜与转轴的方向根据说明书调整（角转离心机的情况是膜与轴垂直）。在实际使用中，一般转速 开的比说明书里的要低，这样可以延长离心管的使用寿命。
4、当浓缩到剩下1ml时，【取50ul国产Bradford溶液，加入10ul流穿，看有没变蓝色，以此判断超滤管是否漏掉蛋白。如果管漏了，将 上层和流穿重新倒入新管中开始超滤。要精确判断是否漏管，用5mg/ml的BSA离心10min，再取流穿，跑蛋白胶或Bradford粗测】，继续加入 剩下的蛋白液浓缩（在冰上操作，防止蛋白受热），直到所有浓缩液都加完为止。离心过程中注意是否发生蛋白沉淀，导致堵管。若发生沉淀，要确定沉淀的具体原 因，是蛋白浓度过高还是Buffer不合适；前者可用多根超滤管同时超滤，降低浓度的办法解决，后者的方法是换不同的Buffer，直到蛋白不发生沉淀为 止。
5、前面几步用以浓缩蛋白，如果要换Buffer，在总蛋白液浓缩至1ml左右的时候，轻轻加入新的Buffer（经0.22um超滤膜超滤），再 浓缩至1ml左右，连续三次，最后一次的浓缩终体积根据需要的蛋白浓度而定，一般不多于500ul，也有浓缩至200ul以内的情况。按照每次至少10倍 左右的体积浓缩算，三次达到1000倍以上，基本上可以达到换buffer的目的。
6、取出最终蛋白浓缩液的操作在冰上操作，用黄枪头（200ul）取，轻轻顺着边缘插入枪头，轻轻吹打、混匀蛋白液，注意不要碰到超滤膜，然后吸取 浓缩液，每次吸接近200ul，直到吸完。管底剩下的最后一点浓缩液不必吸取，否则难度
太大，有可能损坏超滤膜。最后加入MilliQ水到超滤管中，没过 超滤膜，防止膜失水变干。
7、以下是处理超滤管，重复利用超滤管的步骤。
8、倒出超滤管里的水，用milliQ水轻轻润洗几次，【若管底有可见的蛋白沉淀，可以先加入水，然后用枪头吹打，注意不要碰到膜，吹打至沉淀悬 起，然后倒掉，不可用自来水猛冲】然后加入0.2M的NaOH溶液，室温放置20min，期间平衡超滤管。再离心10min。倒出残留的NaOH溶液，将 管芯浸入MilliQ水的烧杯(1或2L)中,放置几个小时,再换新的水,放置几个小时，不断稀释NaOH浓度。50ml管和盖子用自来水洗，内壁再用 MilliQ水洗干净。
9、取出浸没的管芯，加至接近满的MilliQ水，50ml管也加满MilliQ水，将管芯慢慢放入50ml离心管，排出部分水，然后盖上盖子，放4度保存，直到下次使用。一般来说，按照上述步骤和注意事项，每根管用三四年不会坏。
实验室常用储存液的配置参数
1．30%丙烯酰胺溶液
【配制方法】将29g丙烯酰胺和1g N，N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60ml的水中。加热至37℃溶解之，补加水至终体积为100ml。用Nalgene滤器（0.45μm孔径）过滤除菌，查证该溶液的pH值应不大于7.0，置棕色瓶中保存于室温。
【注意】丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收，其作用具累积性。称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也 应谨慎操作，因为它还可能会含有少量未聚合材料。一些价格较低的丙烯酰胺和双丙烯酰胺通常含有一些金属离子，在丙烯酰胺贮存液中加入大约0.2体积的单床 混合树脂（MB-1Mallinckrodt），搅拌过夜，然后用Whatman 1号滤纸过滤以纯化之。在贮存期间，丙烯酰胺和双丙烯酰胺会缓慢转化成丙烯酰和双丙烯酸。
2．40%丙烯酰胺
【配制方法】把380g丙烯酰胺（DNA测序级）和20g N，N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为600ml的蒸馏水中。继续按上述配制30%丙烯酰胺溶液的方法处理，但加热溶解后应以蒸馏水补足至终体积为1L。
【注意】见上述配制30%丙烯酰胺的说明，40%丙烯酰胺溶液用于DNA序列测定。
3．放线菌素D溶液
【配制方法】把20mg放线菌素D溶解于4ml 100%乙醇中，1：10稀释贮存液，用100%乙醇作空白对照读取OD440值。放线菌素D（分子量为1255）纯品在水溶液中的摩尔消化系数为 21，900，故而1mg/ml的放线菌素D溶液在440nm处的吸光值为0.182，放线菌素D的贮存液应放在包有箔片的试管中，保存于-20℃。
【注意】放线菌素D是致畸剂和致癌剂，配制该溶液时必须戴手套并在通风橱内操作，而不能在开放在实验桌面上进行，谨防吸入药粉或让其接触到眼睛或皮肤。
药厂提供的作治疗用途的放线菌素D制品常含有糖或盐等添加剂。只要通过测量贮存液在440nm波长处的光吸收确定放线菌素D的浓度，这类制品便可用于抑制自身引导作用。
4．0.1mol/L腺苷三磷酸（ATP）溶液
【配制方法】在0.8ml水中溶解60mg ATP,用0.1mol/L NaOH调至pH值至7.0，用蒸馏水定容1ml，分装成小份保存于-70℃ 5．10mol/L乙酸酰溶液 【配制方法】把770g乙酸酰溶解于800ml水中，加水定容至1L后过滤除菌。 6．10%过硫酸铵溶液 【配制方法】把1g过硫酸铵溶解于终量为10ml的水溶液中，该溶液可在4℃保存数周。 7．BCIP溶液
【配制方法】把0.5g的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸二钠盐（BCIP）溶解于10ml 100%的二甲基甲酰胺中，保存于4℃ 8．2×BES缓冲盐溶液
【配制方法】用总体积90ml的蒸馏水溶解1.07g盐溶液BES[N，N-双（2-羟乙基）-2-氨基乙磺酸]、1.6g NaCl和0.027g Na2HPO4，室温下用HCl调节 该溶液的pH值至6.96、然后加入蒸馏水定容至100ml，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成小份，保存于 -20℃。 9．1mol/L CaCl2溶液
【配制方法】在200ml蒸馏水中溶解54g CaCl2?6H2O，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成10ml小份贮存于-20℃。 【注意】制备感受态细胞时，取出一小份解冻并用蒸馏水稀释至100ml，用Nalgene滤器（0.45μm孔径）过滤除菌，然后骤冷至0℃。 10．2.5mol/L CaCl2溶液
【配制方法】在20ml蒸馏水中溶解13.5g CaCl2?6H2O，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于-20℃。 11．1mol/L二硫苏糖醇（DTT）溶液
【配制方法】用20ml 0.01mol/L乙酸钠溶液（pH5.2）溶解3.09g DTT，过滤除菌后分装成1ml小份贮存于-20℃。 【注意】DTT或含有DTT的溶液不能进行高压处理。
12．脱氧核苷三磷酸（dNTP）溶液
【配制方法】把每一种dNTP溶解于水至浓度各为100mmol/L左右，用微量移液器吸取0.05mol/l Tris碱分别调节 每一dNTP溶液的pH值7.0（用pH试纸检测），把中和后的每种dNTP溶液各取一份作适当稀释，在给出的波长下读取光密度计算 出每种dNTP的实际浓度，然后用水稀释成终浓度为50mmol/L的dNTP，分装成小份贮存于-70℃。 13．0.5mol/l EDTA(pH8.0)溶液
【配制方法】在800ml水中加入186.1g二水乙二胺四乙酸二钠
（EDTA-Na?2H2O），在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节 溶液的pH值至8.0（约需20g NaOH颗粒）然后定容至1L，分装后高压灭菌备用。
【注意】EDTA二钠盐需加入NaOH将溶液的pH值调至接近8.0，才能完全溶解。
14．溴化乙锭（10mg/ml溶液）
【配制方法】在100ml水中加入1g溴化乙锭，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，然后用铝箔包裹容器或转移至棕色瓶中，保存于室温。
【注意】小心：溴化乙锭是强诱变剂并有中度毒性，使用含有这种染料的溶液时务必戴上手套，称量染料时要戴面罩。 15．2×HEPES缓冲盐溶液
【配制方法】用总量为90ml的蒸馏水溶解1.6g NaCl、0.074g KCl、0.027g Na2PO4?2H2O、0.2g葡聚糖和1gHEPES，用0.5mol/l NaOH调节 pH值至7.05，再用蒸馏水定容至100ml。用0.22μm滤器过滤除菌，分装成5ml小份，贮存于-20℃。
16．IPTG溶液
【配制方法】IPTG为异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（分子量为238.3），在8ml蒸馏水中溶解2g IPTG后，用蒸馏水定容至10ml，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于-20℃。 17．1mol/L乙酸镁溶液
【配制方法】在800ml水中溶解214.46g四水乙酸镁，用水定容至1L过滤