发布时间 : 星期三 文章HBsAg--主要生产工艺及反应体系更新完毕开始阅读7a013b68a45177232f60a22e
乙型肝炎病毒表面抗原检测试剂盒(胶体金法) 生产工艺研究及反应体系的建立研究资料
目录
A、研究择要--------------------------------------------------------------------------------------------------第2页 B、缩略语------------------------------------------------------------------------------------------------------第5页 C、正文
一、.主要生产工艺描述及确定依据---------------------------------------------------------------第6页 二、反应体系的组成----------------------------------------------------------------------------------第16页 三、被测样本的要求----------------------------------------------------------------------------------第17页 四、试剂用量--------------------------------------------------------------------------------------------第19页 五、体系的反应条件---------------------------------------------------------------------------------第20页 六、体系的有效性确定方法(校准、质控方法) ---------------------------------------------第21页 附图1 乙型肝炎病毒表面抗原检测试剂盒（胶体金法）生产工艺流程图---------------第
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A、研究择要
本检测试纸是由固相有纯化的高特异性鼠抗HBsAg单克隆抗体A(检测线)和羊抗鼠IgG多克隆抗体(对照线)的硝酸纤维素膜、吸附有胶体金标记抗HBsAg单克隆抗体B的无纺布膜、玻璃纤维、吸水纸等其它辅料因此粘贴制成，用于定性的检测人血清/血浆中乙型肝炎病毒表面抗原。
当进行检测时，若为阳性标本，样本中的HBsAg与金标记的抗HBsAg抗体B结合形成复合物，此复合物由于层析作用沿试纸条向前移动，则与检测线区固相的抗HBs抗体A形成“固相抗HBsAg抗体A -HBsAg-金标记抗HBsAg抗体B” 双抗体夹心复合物而凝聚显色；若为阴性标本，在检测线区域不能形成双抗体夹心复合物，因此不显色。
无论HBsAg是否存在于测试样本中，一条有色条带都会出现在对照线区内。对照线区内所显现的有色条带是判定是否有足够标本，层析过程是否正常的标准，同时也作为试剂的内控标准。若无对照线出现，则实验无效。
通过对样本用量、试剂用量、反应温度、质控方法等研究，建立制造工艺和质控方法，确定本检测试纸的操作步骤、结果判定以及注意事项等，最终建立生产工艺和反应体系。
B、缩略语
编号 1 2 3 4 名词 乙型肝炎病毒五项标志物 乙型肝炎病毒表面抗原 鼠抗HBs单克隆抗体 羊抗鼠IgG多克隆抗体 缩略语 HBV HBsAg 鼠抗HBs抗体 GAM 第 2 页 共 23 页
C、正文
1、主要生产工艺过程 1.1金标抗体反应膜制备 1.1.1参数设置
表1 胶体金标记参数
A104 0.8％ 胶体金－CG(单位：μg/ml) 原料名称 鼠抗HBsAg单克隆抗体B (Y－002/ HBsAg) 最适标记量 15 0.4% 35 7.5±1 A103 最适OD值 配对宽度（mm） 1.1.2金标反应膜制备
表2 金标反应膜清单
物料编码 F-002-3 Y-002/ HBsAg 辅料名称 无纺布 鼠抗HBsAg单克隆抗体B 规格 38cm×27cm / 批配料量（1000板） 30张 120mg 注：(1)Y-002/ HBsAg的包装规格可以不同，但是总量一定。
(2) 此规格每张有效长度均以34cm计，折合34板(每板宽度1cm)。
1.1.2.1胶体金溶液制备
在加热煮沸的3800ml纯化水中快速加入A102溶液80ml，待溶液再次沸腾后，迅速加入A101溶液80ml，继续煮沸，观察溶液颜色由黄色变黑再变紫，最后变成稳定的酒红色后，计时继续加热10分钟即可。待溶液冷却至室温后，加入纯化水补充至4000ml。共制备2瓶。
备注：每1000板需要该比例胶体金溶液的体积为8000毫升。 1.1.2.2胶体金-抗体结合物制备：
标记原料：鼠抗HBs 单克隆抗体B (Y-002/ HBsAg)
每4000ml胶体金溶液，首先加入32ml A104，混匀，将上述胶体金溶液按照15μg/ml的比例加入Y-002/ HBsAg (即每1000ml需要Y-002/ HBsAg的重量为15mg)，混匀，静置5分钟，然后加入A103溶液16ml，混匀，静置5分钟。经3次30分钟的离心，离心速度为：5000rpm、7000rpm、9000rpm，合并三次收集的沉淀(体积V1)。
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1.1.2.3金标反应膜制备
合并沉淀体积为V1，取30ul沉淀100倍稀释测524nmOD值A(A>0.5)，按100A*V1=35*V2加金标结合物稀释液稀释沉淀至体积V2即制得金标抗体溶液；将制得的金标抗体溶液按每张无纺布涂布10ml均匀涂布，室温晾干18－20小时即可。 1.1.2.4分切
将晾干的金标反应膜按照中间体配对确定的宽度进行分切(通常7.5±1 mm)，记做生产中间体条组分S4。铝箔袋密封，室温存放。 1.2硝酸纤维反应膜制备
表3 包被参数
检测线－T(单位：mg/ml) 原料名称 鼠抗HBsAg单克隆抗体A Y－001/ HBsAg 稀释浓度 1.5 对照线－C(单位：mg/ml) 原料名称 羊抗鼠IgG多克隆抗体 Y－003/GAM 稀释浓度 1.0 表4 硝酸纤维素膜固相准备
物料编码 F-001-3 HBsAg 01 辅料名称 硝酸纤维膜 HBsAg 01包被液 规格 27cm×16cm 1.5mg/ml 批配料量（1000板） 125张 60mg HBsAg 03 HBsAg 03包被液 1.0mg/ml 40mg 注：(1) 每ml包被液可以包被25板；每1000板需要40ml包被液； (2) 每张硝酸纤维膜计为8板；
(3) 硝酸纤维反应膜沿膜上密虚线标志线分切。
1.2.1包被
(1) 抗HBs单克隆抗体A(检测线)、羊抗鼠lgG多克隆抗体(对照线)使用B101分别稀释至1.5mg/ml、1.0mg/ml，分别加入喷点包被机的1号杯、2号杯；
(2) 调试自动喷膜机，喷液量设定为1.4μl/cm，导轨速度6.0cm/sec。喷嘴1与2间隔5mm.。
(3)包被后的硝酸纤维素膜过夜晾干。 1.2.2封闭
(1) 按每100ml B102+900ml纯化水浸泡5张（折40板）膜计，将包被好的膜浸入封闭2小时；
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