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细菌鞭毛染色及活菌运动观察
一、目的要求：
1、 学习并掌握鞭毛染色法并了解鞭毛的形态特征 2、 巩固显微镜操作技术及无菌操作技术 3、 学习压滴法观察细菌（活细胞）运动性
二、实验器材：
1. 菌种来源
枯草芽孢杆菌1-2d牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物，铜绿假单胞菌1-2d牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物 2. 溶液和试剂
稀释美蓝溶液，质量分数为95%的乙醇水溶液，蒸馏水，硝酸银染液A液和B液 3. 仪器和其它用品
酒精灯，载玻片，盖玻片，显微镜，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，接种环，小试管，烧杯，试管架，载玻片夹子，滴管和滤纸
三、基本原理：
1. 压滴法观察活菌运动
鞭毛是细菌的运动器官，在水中可以高速旋转推动菌体前行，细菌的游动不是单纯地一直朝前游，而是伴随着不时的随机翻滚转向，但从表观上看仍表现为细菌的前行。细菌未染色时无色透明，在显微镜下主要靠细菌的折光率与周围环境的不同来进行观察。若想观察的更加清晰，可以滴加稀释美蓝等染液进行染色，注意不要染色过重，以免影响观察，有鞭毛的细菌运动活泼，且不同时向一个方向运动，而无鞭毛的细菌则呈不规则布朗运动。这样便可以在光学显微镜下观察到细菌的运动。 2. 细菌鞭毛染色法
简单染色法适用于一般的微生物菌体的染色，而某些微生物具有一些特殊结构，如鞭毛、芽孢和荚膜，对它们进行观察之前需要进行有针对性的染色。 鞭毛是细菌的纤细丝状的“器官”。鞭毛的有无、数量及着生方式也是细菌分类的重要指标。鞭毛直径一般为10-30nm，只有用电镜才可以直接观察到。若要用普通光学显微镜观察，必须使用鞭毛染色法。首先用媒染剂（如单宁酸或明矾钾）处理，使媒染剂附着在鞭毛上使其加粗，然后用碱性复红（Gray氏染色法）、碱性复品红（Leifson氏染色法）、硝酸银（West氏染色法）或结晶紫（Difco氏染色法）进行染色。
四、实验步骤：
（一）压滴法观察活细菌 1. 洗片
用自来水和去污粉将载玻片清洗干净，然后用蒸馏水冲洗 2. 涂片
在载玻片上滴加少量蒸馏水，采用无菌操作将所要观察的菌种接种到水滴中蒸馏水稍显浑浊即可。 3. 盖盖玻片
用镊子盖盖玻片时首先使盖玻片的一端接触载玻片上的液滴的一端，然后再将另一端缓缓放下，防止气泡的产生，以免影响观察。 4. 镜检（暗光）
菌体放在蒸馏水中，装片做好后要迅速镜检，以取得最佳的观察效果（细菌相向运动时才能判断细菌的运动）。 （二）细菌的鞭毛染色 1. 洗片
用自来水和去污粉将载玻片清洗干净，然后用蒸馏水冲洗 2. 95%乙醇溶液浸泡
将洗好的载玻片放入盛有95%乙醇水溶液的烧杯中，浸泡5min后取出烧片，将载玻片上的油污等洗掉干燥 3. 涂片
在载玻片的一端滴加少量蒸馏水，采用无菌操作将所要观察的菌种接种到水滴使水滴稍显浑浊，将载玻片倾斜使液滴从载玻片的一端流到另一端，然后用吸水纸吸取多余的液滴。 4. 自然干燥
5. 滴加硝酸银A液
向涂片上滴加适量的硝酸银A液覆盖菌带，染色3-5分钟。 6. 水洗
倾去染液，用轻缓的水流冲洗载玻片背面，至洗出的水无色为止。 7. 硝酸银B液冲洗
用硝酸银B液冲洗涂片，并覆盖菌带0.5-1min，微热。 8. 水洗
倾去染液，用轻缓的水流冲洗载玻片背面，至洗出的水无色为止。 9. 自然干燥 10. 镜检
将做好的涂片放到显微镜下，在菌带上由多到少观察两种菌，以方便找到鞭毛（其中，枯草杆菌的菌体较大，为周生鞭毛，也可能会出现侧生鞭毛的现象，这是因为鞭毛断掉；铜绿假单胞菌菌体较小，为端生鞭毛） 五、实验结果与分析：
（一）此次试验是鞭毛染色和活菌的运动观察，学习了压滴法观察活菌和细菌鞭毛染色的实验方法和步骤，理论上掌握了此次实验的基本原理，但是在实际的操作过程中还是出现了一些问题，像压滴法我接种时细菌接种得太多，在油镜下难以清晰的观察到细菌的运动，看到的大部分是脂质体的流动；另外，吸收多余蒸馏水时过于彻底，以致细菌失去水环境无法运动。在以后的制片中会更加注意这些问题，使得实验结果更加清晰。
（二）在细菌的鞭毛染色中，由于鞭毛比较脆弱，在染色的过程中很容易脱
落，并且鞭毛很细，在油镜下很难观察到鞭毛的着生状态，像枯草芽孢杆菌是周生的鞭毛，但是在显微镜下我们看到的却使侧生的，这将使我们对细菌的种类的判断产生误导作用。但是铜绿假单胞菌的鞭毛是端生的，容易判断，但是需要我们在视野中找到鞭毛。在实验中我觉得鞭毛染色成功的条件有以下几方面： 1. 载玻片清洁、光滑、无油迹是鞭毛染色成功的先决条件。
2. 菌种的菌龄：老龄的菌种的鞭毛极易脱落，因此染色后很难看见有鞭毛，要
选择活跃生长期菌种进行染色。
3. 在盖玻片上接种的时候，只需要在水中轻轻地沾几下即可，不要用力过猛，
更不能用接种环大幅涂开，若动作太重太大，菌种的鞭毛就会被刮落。 4. 银染剂的使用方式和时间很重要：使用前要先摇匀。若时间过短或方式不当，
就很难在媒染剂上着色，那么，我们也就没有办法在显微镜下观察到鞭毛了。 5. 鞭毛染色的玻片最好是自然晾干，加热后菌种易变形，鞭毛易脱落，影响观
察。
（三）枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌的鞭毛油镜照片和绘图
油镜照片 手绘图
（左为铜绿假单胞菌右为枯草芽孢杆菌）
六、思考题：
1. 除鞭毛染色法外，还有什么方法能够观察到鞭毛？ 使用暗视野显微镜能够观察到鞭毛
2. 如果发现鞭毛已和菌体脱落，请解释原因。
可能是选用的老龄菌，鞭毛易脱落；制片过程中剧烈震荡、涂抹菌液，或用加热法进行固定的。