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姓名：何青 学号：1224143003 专业：生物医学信息技术
荧光显微成像技术在生物医学研究领域的应用
随着光电子技术，尤其是激光技术的发展，越来越多的现代显微技术迅速发展起来。目前，通过激光光源以激发被测物体的荧光或者非线性光学现象从而获得高分辨率的成像的技术就有：激光共聚焦显微技术、双光子荧光显微技术、二次谐波显微成像技术以及拉曼光谱成像技术等。
通过能量密度比普通光源高数十乃至数百倍的激光可以激发被测物的各种非线性光学现象，而被测物内部不同组织、不同成分的部分将显示不同的光学性质（如激发光的强度或者波长不一样），从而将这些不同部分区分开来，提高了显微系统的分辨率。
荧光显微成像技术在生物医学研究领域的应用日益广泛，技术发展也突飞猛进，成为热门的研究领域，并发展了突破衍射极限的超高分辨率荧光显微成像系统[1]。现就目前应用比较广泛的激光扫描共焦显微镜和多光子激光扫描显微镜进行介绍。
1 激光扫描共焦显微镜
激光扫描共焦显微镜是近年来发展较为迅速的无创诊断技术。它以光学系统的共焦成像为基础，利用光扫描技术对样品进行无创动态测量，目前已经发展成为生物学和医学研究诊断的重要工具，在生物医学的各方面得到了广泛的应用。
1.1 激光共聚焦扫描显微镜基本原理
如图1所示，激光共聚焦扫描显微镜（Confocal laser scanning microscope，CLSM）用激光作扫描光源，采用双针孔的结构以形成物像共轭。激光通过透镜聚焦在焦平面上针孔形成点光源，并在物镜焦平面对样品逐点扫描,
样品上的每个照射点在像焦平面的探测孔处成像。进行点扫描时，扫描点以外的点不会成像。，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。由于激光束的波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍。系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像。逐点、逐行、逐面快速扫描成像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。
图1激光共聚焦扫描显微镜基本原理示意图 1.2激光共聚焦显微镜的应用领域
激光扫描共聚焦显微镜是近代最先进的细胞生物医学分析仪器之一。既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量, 配合焦点稳定系统可以实现长时间活细胞动态观察。目前，激光扫描共聚焦显微技术已用于细胞形态定位、立体结构重组、动态变化过程等研究，并提供定量荧光测定、定量图像分析实用研究手段，结合其他相关生物技术，在形态学、生理学、免疫学、遗传学等领域得到广泛应用。
激光共聚焦显微镜的具体应用领域包括：
多重荧光影像 ( Multi-Color Fluorescence Imaging ) 3D 立体影像重建 ( 3D Reconstruction ) 3D 动态影像获取与分析 ( Dynamic 3D imaging ) 神经立体分布影像 ( 3D Neuron imaging ) 形态与动态分析 ( Morphology )
次微米单晶荧光影像技术 ( Nano-crystal )
多重荧光蛋白影像技术 ( Multi-Color GFP Imaging )
细胞离子流定量分析 ( Cellular Ion Concentration and Ratio Imaging )
长时间影像记录 ( Time-Lapse Recording ) Z轴扫描与测量 ( Z-section and measurement )
基因影像分析 ( Genetic FISH imaging and quantification ) 染色体多重荧光原色表现 ( Chromosome spectral analysis ) 活体胚胎研究 ( Embryo, Zebrafish / Drosophila embryo ) 穿透光影像 / 反射光影像
材料表面分析 ( Surface and roughness analysis ) 材料显微硬度分析 ( Micro-Hardness analysis ) 晶园分析 ( Wafer analysis ) 薄膜分析 ( Thin layer analysis ) 2 多光子激光扫描荧光显微镜
近年来，光学显微镜技术中的一个最引人注目的成就是双光子激发现象(two-photon excitation，简称TPE)在共焦激光扫描显微镜(confocal laser
scanning microscopy，简称CLSM)中的广泛应用? ．随着飞秒激光技术和光学显微镜技术的发展，现在人们已经能够比较容易地制造并使用双光子共焦激光扫描显微镜(two—photon laser scanning microscopy，简称TPLSM)，对样品在双光子激发后发出的荧光进行观察和三维成像．
目前, 以双光子技术为代表的多光子技术已经在生物及医学成像、单分子探测、三维信息存储、微加工等领域得到广泛应用, 为开拓新学科和促进科学研究领域向更高层次发展起到了非常重要的作用．利用双光子共焦激光扫描显微镜的特点揭示了许多新现象和新规律， 展示了广阔的发展前景。 2.1多光子激光扫描荧光显微镜基本原理
多光子激光扫描荧光显微镜在激光照射下，基态荧光分子或原子吸收一个光子后成为激发态，随后又弛豫到某一基态，同时以光子形式释放能量而发出荧光．这一过程就是通常的单光子激发情况．1931年，Maria G6ppert—Mayer预言一个分子或原子可以在同一个量子过程中，同时吸收两个光子而成激发态，这种情况就是双光子激发过程 ．1961年，Kaiser等在CaF2：Eu” 晶体中首次观察到了这种双光子激发现象．比如在单光子激发情形，NADH酶在350nm 的光激发下产生450nm的荧光，而在双光子激发情形，NADH酶则需同时吸收两个700nm的光子才能产生450rim的荧光．这就是说，双光子技术可以使我们无需使用紫外光源就能达到检测紫外荧光探针的目的，由于双光子激发所产生的荧光强度与激发光的光强平方成正比，因而与单光子激发的线性过程相比，双光子激发就需要很强的激发光强，这就使双光子激发具有很高的空间局域特点[2]。