发布时间 : 星期五 文章自由基及检测方法更新完毕开始阅读7d70234833687e21af45a94a
准曲线法、标准加入法等可以直接对待测组分进行很好的定量分析。 需要注意的是：不同的反应体系需要不同的PH条件。 荧光分析法 荧光探针法
原理：荧光探针法测定技术的核心是荧光探针 , 探针本身应该没有荧光或只有很弱的荧光 , 能很容易通过细胞膜 , 但在细胞或细胞器内被自由基氧化后发出较强的荧光。
常用的荧光探针有 2 ,7-二氯荧光黄乙酰乙酸 （DCFH-DA）、DAF-FMDA 、 双氢罗丹明123 (DHR) 、 二氢乙锭(DHE) 等 可检测O2- 、 · OH 和NO
DCFH-DA具有亲脂性 , 很容易通过细胞膜 , 进入细胞后在细胞内脂酶的作用下脱去乙酸盐基团成为有极性的 DCFH , 但 DCFH不产生荧光 , 细胞胞浆中的氧化物能够氧化 DCFH 为能发出很强荧光的 2 ,7-二氯荧光素(DCF) ,激发波长为488nm,发射波长为525nm。DCF 形成量与细胞氧化物水平成正比例关系 , 因此 , 其荧光强度间接代表细胞内过氧化物的水平。
可检测： O2- ·、 OH ·
DAF-FMDA可以穿过细胞膜(cell-permeable)，进入细胞后可以被细胞内的酯酶催化形成不能穿过细胞膜的DAF-FM。DAF-FM本身仅有很弱的荧光，但在和一氧化氮反应后可以产生强烈荧光，激发波长为495nm，发射波长为515nm。 可检测：NO
DHR本身没有荧光，它被氧化后（与单线态氧结合）就生成具有强荧光性质的RH。 使用 DCFH-DA 与 DHR 时 ,仪器的激发波长 488 nm , 发射波长在 525 或 530 nm 左右。 测胞浆内自由基 , 往往用 DCFH-DA 探针 ; 而测线粒体内的自由基 , 则常用 DHR 作荧光探针。 可检测：O2-、·OH
DHE能自由透入细胞内被O2-直接氧化成溴化乙锭(EB) , EB 的荧光强度与O2-浓度成正比 , 从而间接反映O2-的含量。使用 HE时 , 仪器的激发波长 488 nm , 发射波长在 610 或650 nm 左右 可测：O2-
任何可以检测fluorescein的仪器，包括荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪、荧光分光光度计或荧光酶标仪都可以用于该荧光探针的检测。
2-吡啶甲醛苯并噻唑啉只能被O2-氧化，而共存的双氧水和羟基自由基都不能使其在测定波长下的荧光发生变化，所以探针试剂对O2-具有专一性。
激光诱导荧光成像法是目前惟一的·OH直接检测方法,它是利用激光照射· OH使其发出特征荧光,用特殊相机记录荧光密度,从而测算被测分子基团浓度。 荧光光度法
用荧光光度法来检测自由基的含量时 , 使用的捕获剂在捕获自由基后会发生荧光强度的变化。
利用物质吸收较短波长的光能后发射较长波长特征光谱的性质，对物质定性或定量分析的方法。可以从发射光谱或激发光谱进行分析。 可以检测：·OH、LPO
在常见的捕获剂中 , 荧光强度减弱的捕获剂有 Ce3 +、 罗丹明 6G、 水杨基荧光酮 , 而荧光增强的有苯甲酸、Hantzsch 反应等 , 下面就分别从这两方面介绍常见捕获剂的应用。 1．1 荧光减弱的捕获剂
方光荣等研究了 OH · 与 Ce3 +的反应 , 表明在酸性条件下 , 有强荧光的 Ce3 +被氧化生成无荧光的 Ce4 +。 测定反应前后荧光强度的下降可间接测定羟基自由基的含量 , 该方法可作为筛选抗氧化剂的方法。
碱性介质中罗丹明 6G能产生特征荧光 , 其最大激发波长和发射波长分别为 350和 550 nm , Mn2 +-H2O2 体系在碱性介质中产生的羟自由基可以迅速氧化罗丹明 6G使其荧光猝灭 , 如果存在抗氧化物质可以清除羟自由基 , 便会使溶液的荧光猝灭程度降低 , 据此建立了测定抗氧化活性的方法。
任凤莲等人的实验发现 Co2 +与 H2O2 反应生成羟自由基的产率比 Fenton 试剂高100 倍以上。采用水杨基荧光酮 (SAF)-Co2 +-H2O2 荧光法测定羟自由基的新体系 , 激发波长和发射波长为 510 和 500 nm , 测定体系在反应前后的荧光变化 ,可间接测定羟自由基的产生量。
除了这几种常见的捕获剂外 , 还有一些研究者采用了其他的试剂 , 荧光素钠本身能产生特征荧光 , 其激发波长和发射波长分别为 491 和 512nm。
在碱性介质中 , Mn2 +-H2O2 体系产生的羟自由基可以迅速氧化荧光素钠使荧光猝灭。 张爱梅等提出检测 Fenton 反应产生羟自由基的方法。 羟自由基与吖啶红发生反应后 , 吖啶红的荧光强度减弱 , 测定其荧光强度的变化 , 可间接测定羟自由基的产生量。 1．2 荧光增强的捕获剂
谷学新等利用 Fenton 反应产生的羟基自由基氧化 DMSO 生成的甲醛与乙酰丙酮、 氨发生 Hantzsch 反应 , 产物 3 ,5-二乙酰-1 ,4-二氢吡啶产生特征荧光 , 其最大激发波长和最大发射波长分别为 491 和 512 nm。 通过测定荧光强度的变化可以间接定量测定羟基自由基的产生量。 荧光光度法可以定量
A=?cl ?、l为常数，可以根据所得的A计算出c 激发波长，荧光波长
激发波长：仪器给出的激发光波长
荧光波长：样品被激发光照射后，发出荧光的波长 CE 铈shì HPLC
HPLC法测定需要先用捕捉剂捕获自由基，捕捉剂应能与自由基反应形成稳定的结合物，且易于分离与检测。一般的·OH捕捉剂是安息香酸/水杨酸(SA)、苯二甲酸、二甲亚砜(DMSO)等。·OH与二甲基亚砜反应生成甲磺酸,可以通过HPLC来测定其含量,从而推测·OH的含量。
这种方法具有测量方便,高效,灵敏度高,检测限可达10-9~10-11g等优点，但是,又因为它需要昂贵的设备并且反应过程比较复杂,有很多的中间产物与支线产物,所以在自由基的准确定量检测上,仍显不足。 HPLC定性定量
定性：用“标样”的保留值定出被测组分的位置。
定量：定量分析的具体内容：确定样品的类型，主要成分/痕量成分；使分析条件的分离度（R）大于1.5；色谱峰的定性，峰一致性测定；检测限及定量限（确定灵敏度及线性范围）； 用标样建立标准曲线 常用的定量方法：
1. 峰面积百分比法：由于检测技术的影响，在液相色谱中不常 公式：C%=（Ai/∑Ai）*100%
特点：各组分要全部流出、全部被检测，并对检测器的响应值一样简单，液相色谱目前很难做到这点；与进样量无关；不需标样；简单 2.外标法：在液相色谱中用的最多 配制一系列已知浓度的标样
计算公式： 校正因子：RF（xi）=标样浓度C（Xi）/ 标样响应值R（Xi） 未知组分的浓度：Ci=RF（Xi）* 样品响应值Ai
特点：无需各组分都被检出、洗脱；需要标样；标样及样品测定的条件要一致；进样体积要准确
3.内标法：准确，但是麻烦；在标准方法中用的最多 配制一系列浓度的标样，其中加有内标样 计算公式：
校正因子：RF（xi）=内标样响应值R（I.S）/标样响应值R（Xi）*标样浓度C（Xi） 未知组分的浓度：Ci=RF（Xi）*（样品峰面积Ai/内标峰面积Ai.s）
特点：无需各组分都被检出、洗脱；需要标样，需要内标样；结果与进样体积无关
自动电位滴定法
电位滴定法与直接电位法的不同在于，它是以测量滴定过程中指示电极的电极电位（或电池电动势）的变化为基础的一类滴定分析方法。滴定过程中，随着滴定剂的加入，发生化学反应，待测离子或与之有关的离子活度（浓度）发生变化，指示电极的电极电位（或电池电动势）也随着发生变化，在化学计量点附近，电位（或电动势）发生突跃，由此确定滴定的终点。
在滴定管末端连接可通过电磁阀的细乳胶管，此管下端接上毛细管。滴定前根据具体的滴定对象为仪器设置电位（或pH）的终点控制值（理论计算值或滴定实验值）。滴定开始时，电位测量信号使电磁阀断续开关，滴定自动进行。电位测量值到达仪器设定值时，电磁阀自动关闭，滴定停止。
现代的自动电位滴定已广泛采用计算机控制。计算机对滴定过程中的数据自动采集、处理，并利用滴定反应化学计量点前后电位突变的特性，自动寻找滴定终点、控制滴定速度，到达终点时自动停止滴定，因此更加自动和快速。
其原理是: 以过量的Fe2+与羟基自由基反应, 然后用重铬酸钾返滴剩余的 Fe2+, 进而可以计算出羟基自由基浓度。自动电位滴定法以铂电极为指示电极, 双盐桥饱和甘汞电极作为参比电极, 根据滴定过程中化学计量点附近的电位突跃来确定电位滴定终点, 并记录化学计量点电位值 E0。锁定此电位值后, 由仪器完成待测样品的自动滴定过程。 滴定过程中的主要反应式: H++Fe2++·OH→Fe3++H2O
Cr2O72-+6Fe2++14H+→6Fe3++2Cr3++7H2O
由于电位滴定中所测得是相对电位变化, 而不是绝对值, 所以在直接电位法测量中的一些影响因素,可以忽略不计, 另一方面由于终点电位突跃变化大,测定中标准电位不稳定所引起的滴定误差是很小的,这就容易得到准确的结果, 特别是对测定较高浓度的样品, 其优点更为明显。 自动电位滴定法评价
将电化学分析和氧化还原法结合起来，与氧化还原滴定相比，自动电位滴定由于不受指示剂以及人为判断滴定终点的影响，操作过程中误差小，分析结果准确度高、稳定性好。 该方法终点判断简单、操作简单、测定快速、成本低廉，可作为一种简便易行的测定羟自由基浓度的方法。
极谱法
极化电极（滴汞电极）通常和极化电压负端相连，参比电极（甘汞电极）和极化电压正端相连。当施加于两电极上的外加直流电压达到足以使被测电活性物质在滴汞电极上还原的分解电压之前，通过电解池的电流一直很小（此微小电流称为残余电流），达到分解电压时，被测物质开始在滴汞电极上还原，产生极谱电流，此后极谱电流随外加电压增高而急剧增大，并逐渐达到极限值（极限电流），不再随外加电压增高而增大。这样得到的电流-电压曲线，称为极谱波。极谱波的半波电位E1/2是被测物质的特征值，可用来进行定性分析。扩散电流依赖于被测物质从溶液本体向滴汞电极表面扩散的速度，其大小由溶液中被测物质的浓度决定，据此可进行定量分析。
·OH氧化二甲亚砜（DMSO），生成的甲醛和乙酰乙酯和氨发生Hantzsch反应，反应产物3,5-二乙氧基羰基-2,6-二甲基-1,4-二氢吡啶在-1.09V（对饱和甘汞电极）处有一灵敏的二阶导数极谱峰。通过电流变化可间接测定·OH产量，可用于筛选自由基清除剂和在线测定·OH。此法灵敏度高、操作简便。