发布时间 : 星期四 文章基因工程复习题及参考答案更新完毕开始阅读7d8f110b4a7302768e99397b
3．插入失活法和插入表达法筛选重组体的主要差别是什么？ 答：主要差别是：
(1) 插入失活法是直接根据失活基因的表型变化来筛选重组体。
(2) 插入表达法是根据一个基因的失活引起另一个基因的表达表型来选择。
4．一个携带有氨苄和卡那霉素抗性基因的质粒被仅在卡那霉素基因中有识别位点的EcoR I 消化。消
化物与酵母DNA 连接后转化对两种抗生素都敏感的E. coli 菌株。
(1) 利用哪一种抗生素抗性选择接受了质粒的细胞？ (2) 怎样区分接受了插入酵母DNA 的质粒的克隆？ 提示：(1) 选择Ampr 的转化子；
(2) 所需的克隆是Ampr 和Kans。任何能够抗这两种药物的克隆都是自连的非重组质粒。 5．用EcoR I 和Hind III 分别切割同一来源的染色体DNA，并进行克隆。在前者的克隆中筛选到A 基
因，但在后者的克隆中未筛选到A 基因，请说明原因。 提示：因为HindH I 的切点位于A 基因内。
6．什么是Western 印迹? 它与Southern 印迹有什么不同？
提示：Western 印迹是将蛋白质经电泳分离后从凝胶中转移到固相支持物上，然后用特异性的抗体
进行检测。它与Southern 印迹的不同在于探针的性质不同，在Western 印迹中使用的探针是抗体(蛋白
质)，而Southern 印迹中使用的探针是DNA。
7．用一限制性内切核酸酶切割Lac+ Tetr 的质粒载体，已知该酶识别的是4 个碱基序列，并产生有两个
碱基突出的单链末端，该酶在lac 基因内有切割位点，并在第二个氨基酸密码子内，该位点可以被任何
氨基酸所取代而不影响酶活性。用该酶切割后，用DNA 聚合酶将单链末端补齐为双链的平末端，然后
重新连接成环，转化Lac- Tet- 受体菌，筛选Tetr 转化子，问：Lac 的基因型是什么？并说明原因。
提示：基因型是lac—，原因是在该密码子中插入了两个碱基，造成了移码突变，所以Lac 的基因是 缺陷的。
8．严谨杂交实验是如何控制的？
答：杂交反应的严谨程度由下面两个因素所决定：温度和盐浓度。强的碱基对能耐受高的温度，而
高的盐浓度使弱的碱基对间的配对变得稳定。因此，高度严谨的杂交在高温和低盐浓度下进行，而低
严谨型杂交在低温和高盐浓度下进行。
9．RNA 与基因组DNA 复性已被广泛用于检测不同类DNA 的转录。DNA 驱动的复性实验与RNA 驱
动的复性实验有何不同？
答：在过量DNA 杂交(DNA 驱动杂交)实验中，基因组DNA 的复性过程中加入少量的放射性标记 RNA。因为DNA 的量大大超过RNA，所以全部RNA 能够与DNA 杂交。同样道理，RNA 驱动的杂
交反应中RNA 过量而DNA 的量受到限制，所以所有的互补DNA 链都能与RNA 杂交。 10．在基因工程中，为了在细菌细胞中表达真核生物的基因产物，为什么通常要用cDNA 而不用基因
组DNA? 为什么要在cDNA 前加上细菌的启动子？
答：这是因为细菌没有内含子剪接系统，并且不能识别真核生物的启动子的原因。 11．如何根据下面的应用设计探针？
(1) 假定你分离纯化了一未知功能的蛋白质，需要确定是何种组织和细胞表达这种蛋白质。 (2) 假定你获得了绵羊的胰岛素mRNA，如何进一步从人的cDNA 文库中获得含人胰岛素的克隆
并使之在E. coli 中表达?
提示：(1) 首先对该蛋白质进行部分测序，然后根据测得的氨基酸序列设计简并引物。 (2) 以该mRNA 为模板反转录，得到cDNA，即可进行标记用作探针。 12．什么是遗传学选择法?
答：所谓遗传学选择法（genetic selection）主要是根据受体细胞接受了重组DNA 分子后所发生的
遗传表型的变化直接选择重组体的方法。遗传表型的变化包括抗药性、缺陷基因的功能互补表型及噬
菌斑的变化等。选择的方法主要是根据平板上可见的表型变化，用于选择的平板包括普通抗生素平板、
插入失活抗生素平板、插入表达抗生素平板、显色平板等，由于这些方法都是直接从平板上筛选，所
以又称为平板筛选法。
13．单链RNA 作为探针，具有哪些单链DNA 探针所没有的优点？ 答：单链RNA 探针的下列优点是单链DNA 探针所没有的：
(1) RNA／RNA 和RNA／DNA 比DNA／DNA 杂交体具有更高的稳定性。因此，杂交可以在更严
格的各件下讲行．杂交后的信号也比较强。
(2) 单链RNA 由于不存在互补双链的竞争性结合，所以杂交效率比较高。 (3) RNA 中不存在重复序列，所以特异性比较高。
(4) 杂交后可用RNase 消化掉未杂交的RNA，因此降低了本底。
14．良好的固相支持物 (如硝酸纤维素滤膜、尼龙膜) 必须具备哪些优良特性？ 答：(1) 同核酸分子具有较强的结合能力，一般要求每平方厘米结合核酸分子的量在10μg 以上。
(2) 与核酸分子结合后，不影响其同探针分子杂交的反应。
(3) 与核酸分子的结合牢固，能经受得住杂交、洗涤等过程而极少脱落。
(4) 非特异性吸附少，在洗膜条件下，能将非特异性吸附在其表面的探针分子洗脱。 (5) 具有良好的机械性能，不宜破碎。 15．以硝酸纤维素滤膜 (Nitrocellulose Filter Membrane) 作为杂交的固相支持物具有哪些优、缺点?
答：优点：
(1) 硝酸纤维素滤膜具有较强的吸附单链DNA 和RNA 的能力，特别在高盐溶液中，结合能力达到
80～100μg／cm2。
(2) 杂交信号本底较低。由于硝酸纤维素滤膜非特异性吸附蛋白质的能力较弱，因此特别适合于那
些涉及蛋白质作用(如抗体和酶等)的非放射性标记探针的杂交体系。 缺点：
(1) 它同DNA 的结合仅是靠疏水性的相互作用，所以并不十分牢固，在洗膜时，特别是在高温条
件下洗膜，DNA 会慢慢脱落，因而影响杂交效率。 (2) 硝酸纤维素滤膜容易碎裂，操作不方便。
(3) 硝酸纤维素滤膜在低盐浓度下同DNA 结合的能力不强，因此不适宜电转移印迹法。 (4) 硝酸纤维素滤膜对于小分子质量的DNA 片段(特别是小于200bp 的DNA 片段)结合能力不强。
16．什么是印迹 (Blotting) 杂交？
答：通过一定的物理学方法将DNA 或RNA 从凝胶上转移到固体支持物(如NC 膜)，然后同液体
中的探针进行杂交。DNA 或RNA 从凝胶向滤膜转移的过程称为印迹，故将这种杂交称为印迹杂交
(Blotting Hybridization)。如Western 印迹、Southern 印迹 、Northern 印迹。 17．什么是斑点杂交（Dot Hybridization）与狭缝杂交（Slot Hybridization）？
答：将DNA 或RNA 样品直接点在固体支持物上，然后与核酸探针进行分子杂交，这种方法称为 斑点杂交。如果借用一种模具，将核酸样品加到模具的狭缝中，通过真空抽滤印迹到滤膜上，然后进
行杂交称为狭缝印迹杂交。
18．什么是原位菌落杂交 (Colony Hybridization)?
答：将生长在或影印在微孔滤膜上的菌落 (或噬菌斑) 原位溶菌，原位进行DNA 变性并原位固定
在滤膜上，然后用放射性标记的探针同固定了的DNA 进行杂交，经放射自显影后，确定哪一个菌落含
有重组的DNA 分子，再从参比平板上选取重组体。 19．说明Southern 杂交的原理和方法。
20．Northern 印迹与Southern 印迹有什么不同？
答：Northern 印迹的原理同Southern 印迹相比有两点不同：
(1) 转移的对象不同，Northern 印迹是将RNA 变性及电泳分离后，将其转移到固相支持物上的过 程。
(2) 虽然RNA 电泳前不需像DNA 那样进行酶切，但也需要变性。不过变性方法是不同的，
它不
能用碱变性，只是在加样前用甲醛、乙二醛或甲基氢氧化银变性，因为碱变性会导致RNA 的降解。
21．思考题：建立了一个基因文库后，如何鉴定一个携带目的基因的克隆？__