发布时间 : 星期五 文章基因工程复习题及参考答案更新完毕开始阅读7d8f110b4a7302768e99397b
的 RNA 水解掉。
10．DNA 连接酶 是基因克隆的分子黏合剂，而 限制性内切核酸酶 被誉为分子克隆的剪刀。
二、选项题（单选或多选）
1．T4 DNA 连接酶是从T4 噬菌体感染的E．coli 中分离的，这种连接酶（ B ）。 A．催化连接反应时既能以ATP 又能以NAD 作为能量来源 B．既能催化平末端连接又能催化黏性末端连接 C. 是一种单肽酶，分子质量为74kDa
D．既能催化单链DNA 连接又能催化双链DNA 连接
2．DNA 连接酶在体内的主要作用是在DNA 复制、修复中封闭缺口，（ A ）。 A．将双链DNA 分子中的5’磷酸基团同3'-OH 末端重新形成磷酸二酯键 B．作用时不消耗能量
C．需要Mn2+等二价辅助离子 D．也可以连接RNA 分子
3．在长模板链的指导下引物延伸合成长的DNA 互补链时应选用 （ D ）。 A. T4 DNA 聚合酶 B．Klenow 酶
C．大肠杆菌DNA 聚合酶I D．T7 DNA 聚合酶 4．末端转移酶是合成酶类，（ C ）。
A．作用时不需要模板 B．在Co2+的存在下，可以在突出的3’端延长DNA 链
C．在Co2+的存在下，可以在隐蔽的3’端延长DNA 链 D．上述说法有两种是正确的 5．在基因工程中，可用碱性磷酸酶 ( AB )。
A．防止DNA 的自身环化 B．同多核苷酸激酶一起进行DNA 的5’端标记 C．制备突出的3’ 端 D．上述说法都正确 6．从E．coli 中分离的连接酶 ( B )。
A．需要ATP 作辅助因子 B．需要NAD 作辅助因子
C．可以进行平末端和黏性末端连接 D．作用时不需要模板 7．下列哪一种酶作用时需要引物? ( C ) A．限制酶 B．末端转移酶 C．反转录酶 D．DNA 连接酶 8．S1 核酸酶的功能是( BCD )。
A．切割双链的DNA B．切割单链的RNA C．切割发夹环 D．以上有两项是正确的
9．K1enow 酶与DNA 聚合酶相比，前者丧失了 ( C )的活性。 A．5’→3’ 合成酶 B．3’→5’ 外切酶 C．5’→3’ 外切酶 D．转移酶
10．只能从DNA 分子的末端水解磷酸二酯键使核苷酸解离下来的酶是( A )。 A．核酸外切酶 B．核酸内切酶 C. DNA 连接酶 D．末端转移酶
11．T4 噬菌体DNA 聚合酶具有两种活性：聚合酶活性和3’→5’外切酶活性（作用于3’突出端），因
此可使黏末端变成平末端。如DNA 片段用一定的限制性内切核酸酶处理后，再置于含T4 聚合酶
及四种三磷酸核苷酸的反应体系中，则下面哪种情况可能发生？( C )
A．在T4 聚合酶的外切酶活性作用下，Bgl II (A↓GATCT)切出的末端被切平 B．在T4 聚合酶的外切酶活性作用下，Bgl II 及Pvu I(CGAT↓CG)切出的末端被切平 C．在T4 聚合酶的外切酶活性作用下，Sac II (CCGC↓GG)及Pvu I 切出的末端被切平 D．在聚合酶活性作用下，Bgl II 及Pvu I 切出的末端被补平 E．在聚合酶活性作用下，Sac II 及Pvu I 切出的末端被切平 12．逆转录酶也称反转录酶，是一种( B )。
A. 依赖于DNA 的DNA 聚合酶 B．依赖于RNA 的DNA 聚合酶 C. 依赖于DNA 的RNA 聚合酶 D．DNA 聚合酶或RNA 聚合酶 13．可以在切口部位起作用的酶是( A )。 A．S1 核酸酶 B．外切酶III
C．λ外切核酸酶 D．Bal 31 核酸酶
三、判断题
1．T4 DNA 连接酶和E．coli 连接酶都能催化平末端和黏性末端的连接。错误，平末端不能
2．T4 DNA 连接酶和E．coli 连接酶都能催化双链DNA 和单链DNA 的连接。错误，都不能催化单链 连接
3．反转录酶能够以单链RNA 或单链DNA 为模板，在引物的引发下合成一条互补的 DNA 链。以RNA
为模板合成的DNA 是互补DNA (Complementary DNA，cDNA)。若是以DNA 模板合成DNA，dNTP
的掺入速度很低（每秒约5 个核苷酸），是T7 DNA 聚合酶合成速度的1％。正确
4．以RNA 为模板，用反转录酶可同时产生单链和双链的cDNA，双链DNA 是由自身引物引导合成。
但这种自身引物引导的合成效率远低于外加寡核苷酸引物引导的 合成。正确
5．Bal 31 核酸酶是Ca2+依赖性的，在反应混合物中加入EDTA 便可抑制它的活性。错误，EGTA 抑制 Ca2+
6．当一个DNA 结合蛋白同它识别的核苷酸序列结合以后，就保护了它们的磷酸二酯键免遭切割，其
结果，电泳胶上就有明显可见的空缺带（与对照相比），这就是DNA 足迹法。正确 7．T4 DNA 连接酶和E．coli 连接酶作用时都需要ATP 和NAD+作为辅助因子。错误，T4 连接酶需要
ATP，E．coli 需NAD+
8．多核苷酸激酶之所以能够用于DNA 片段的标记，是因为它能够将单个的32P 标记的单核
苷酸加到
每一DNA 链的5’端。错误，将ATP 上的3 2P 加到
9．用同一种酶切割载体和外源DNA 得到黏性末端后，为防止它们自身环化，要用CIP 将它们脱磷酸。
错误，不能同时脱磷酸，一般只将载体脱磷酸
10．Nick 和Gap 的含义是不同的，前者指DNA 的单链中有较小的缺失，后者仅是断开了一个磷酸二
酯键。错误，正相反
四、问答题
1．DNA 连接酶的连接机理是什么？
答：DNA 连接酶是利用ATP 或NAD+[烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(氧化型)]提供的能量催化DNA 双链
间的缺口形成磷酸二酯键。 在连接反应中，首先ATP (NAD+)与DNA 连接酶反应，同连接酶生成一种共价结合的酶-AMP 复
合物。其中AMP(腺苷一磷酸)通过一种磷酸酰胺键同DNA 连接酶的赖氨酸残基的ε-氨基相连。同时释
放出焦磷酸或烟酰胺单核苷酸（NMN）。
AMP 激活DNA 一条链的5’-末端磷酸基团, 并转移到磷酸基团上，形成DNA-腺苷一磷酸复合物。
最后，3’-OH 对激活的磷原子作亲核攻击，形成磷酸二酯键，同时释放出AMP。
连接反应是由在形成酶-腺苷酸复合体时，焦磷酸水解和释放提供的能量驱动下进行的。在以ATP
作为能源的连接酶中，一个磷酸二酯键的形成消耗掉两个高能磷酸键。 2．DNA 连接酶的作用特点有哪些？
① 连接反应需要在一条DNA 链的3’末端具有一个游离的-OH, 而另一条DNA 链的5’ 末端具有
一个磷酸基团(-P)的情况下，才能发挥其连接DNA 分子的功能作用，而在末端带有5’-羟基和
3’-羟基；5’-磷酸和3’-二脱氧核苷基团的两个DNA 片段之间不起连接作用。 ② 连接反应中需要 ATP 或NAD+ 和Mg2+ 为辅助因子和激活因子；
③ DNA 连接酶不能够连接两条单链的DNA 分子，被连接的DNA 链必须是双螺旋的一部分。
④ DNA 连接酶只封闭双螺旋DNA 骨架上的缺口 (Nick)，即在双链DNA 的某一条链上两个相邻
核苷酸之间失去一个磷酸二酯键所出现的单链断裂，而不能封闭双链DNA 的某一条链上失去
一个或数个核苷酸所形成的裂口（Gap）。
3．影响DNA 连接酶连接反应的因素主要有哪些？
答：1) 反应温度：最佳反应温度37℃，但黏性末端之间退火形成的氢键结合不稳定，连接黏性末
端的最佳温度，一般认为4～20℃比较合适。
2) DNA 片段末端：不仅要考虑反应体系中DNA 末端的总浓度，还要考虑载体与插入片段的末端
浓度的比例。原则上应保证一个DNA 分子的末端有较高的几率与另一 DNA 分子连接，减少同一个分
子两个末端之间的自身连接。载体与插入片段 3：1 ~ 1：3。
3) 连接酶浓度：平末端DNA 分子的连接反应，最适酶量大约是1～2 单位；而黏末端DNA 片段
间的连接，在同样的条件下，仅为 0.1 单位时，便能得到最佳连接效率。 4．什么是Klenow 酶？有哪些活性？在基因工程中有什么作用？
答：Klenow 酶是1974 年Klenow 用枯草杆菌蛋白酶水解DNA 聚合酶I，得到的两个片段。其中
大片段的分子质量为75kDa，它具有5’→3’聚合酶和3’ →5’外切核酸酶的活性，小片段具有5’→3’外
切核酸酶活性。由于大片段失去了DNA 聚合酶I 中会降解5’引物的5’→3’外切核酸酶活性，所以在基
因工程中更有用。
Klenow 酶主要有下列用途： (1) 修复反应，制备平末端。
可用Klenow 酶修复限制性内切核酸酶或其他方法产生的5’或3’突出端，制备平末端，这样可以
使原来具有不相容的黏性末端的DNA 片段通过平末端重组。如在反应系统中加入放射性同位素标记的
脱氧核苷酸，用这种末端填补的方法可以制备3’端标记的探针。用Klenow 酶修复5’突出端的反应主
要是利用了Klenow 酶的DNA 聚合酶活性，是填补反应；而修复3’突出端则是用Klenow 酶的3’ →5’
外切核酸酶的活性，是切割反应。用Klenow 酶的切割反应来修复3’突出端是不理想的，改用T4 DNA
聚合酶或其他的酶是更好的选择。
(2) 标记DNA 3’突出端 (protruding end)。
该反应分两步进行：先用3’ →5’的外切核酸酶活性除去3’突出端，产生3’隐含末端，然后在高浓
度的标记底物 (32P-dNTP) 存在下，使降解3’ →5’) 作用与聚合 (5’→3’) 作用达到平衡。这种反应也
叫交换或取代反应 (exchange／replacement reaction)。不过这一反应用T4 DNA 聚合酶的效果更好，因
它的3’ →5’的外切核酸酶活性较强。 (3)其他的一些用途。
包括用双脱氧末端终止法进行DNA 序列分析、用于cDNA 第二链的合成、在定点突变中用于合
成第二链、用引物延伸法 (primer extension) 制备单链DNA 探针等。
5．碱性磷酸酯酶主要有两种，细菌碱性磷酸酯酶（BIP）和小牛肠碱性磷酸酯酶（CIP），二者有什么
不同？在基因工程中有什么用途？
答：主要差别是CIP 在68℃时失活，而BAP 在68℃稳定，且耐酚抽提。
应用：①dsDNA 的5’端脱磷酸，防止DNA 的自身连接。但是用CIP 处理后，最好将CIP 除