发布时间 : 星期四 文章基因工程复习题及参考答案更新完毕开始阅读7d8f110b4a7302768e99397b
粒。最大
DNA 克隆片段可达到2000kb。
问题有：(1) YAC 有嵌合现象，一个YAC 中克隆的DNA 片段可能来自两个或多个不同的染色体。
在基因组文库中，嵌合体占克隆总数的10％～60％。
(2) YAC 内部有重组现象，插入的DNA 较大，序列发生重排，导致和原来染色体的序列不一致，
重组很难检出。
(3) YAC 还有缺失现象，影响YAC 文库的代表性。
(4) YAC 结构和酵母天然染色体结构相似，使用常规方法不易将YAC 和酵母天然染色体分开。
(5) 构建好的YAC 转化原生质化的酵母菌，转化效率低。 (6) 建好库后保存方便，但要筛选某个基因时工作量大 6．什么是 BAC？BAC 载体的组成与优缺点有哪些？
① 细菌人工染色体（BAC）是从大肠杆菌F 因子改造构建而来的，能够携带大约300kb 的DNA 插 入片段。
② 载体具有 F 因子的复制起始点（oriS），可使载体维持每个细胞一个拷贝的水平。 ③ 载体包括有 4 个维持DNA 复制和拷贝数目的基因，repE, parA, parB and parC。
④ 具有一个抗生素选择标记基因，和 lacZ’基因。在lacZ’基因中组装有一多克隆位点，便于外源
片段的插入和蓝白反应筛选克隆子。
⑤ 插入的 DNA 片段非常稳定，可以在大肠杆菌细胞中维持数百代，而且不易发生重组和从寄主细胞 中丢失。
⑥ 主要缺点是每个细胞中的拷贝数少（1~2 个），使得分离和筛选较为困难。 7．利用pBR322 质粒插入失活分离带有外源DNA 片段的重组克隆的原理是什么？ ① 外源 DNA 片段插入在pBR322 质粒tetr 基因的编码序列内（BamHI）位点，使该基因失活；
② 体外重组反应混合物转化大肠杆菌 ampstets 菌株，并涂布在amp 琼脂平板上，凡获得了pBR322
质粒和重组质粒(AmprTets)的寄主细胞都可长成菌落；
③ 将 amp 琼脂上的菌落原位影印在tet 琼脂平板上生长，对比这两个平板的菌落生长情况，凡在amp
平板上能够生长而在tet 平板上不能生长的菌落，便是属于带有重组体质粒的转化子克隆；挑出这样
的阳性克隆，扩增分离带有外源DNA 插入片段的重组体质粒。 8. pUC 质粒利用α-互补作用筛选重组子原理是什么？
答：pUC 系列质粒载体是在pBR322 质粒载体基础上改造来的，它用lacZ’ 基因取代了
pBR322
质粒载体上的tetr 基因。lacZ’ 基因编码β-半乳糖苷酶的N 末端1-63 个氨基酸(α-肽链)的DNA 片段, 在
lacZ’ 基因内组入了一个多克隆位点（MCS），但不影响lacZ’基因的功能。 pUC 载体
的宿主（E. coli）
携带一个编码β-半乳糖苷酶C 端序列的基因片段, 它们本身用这个基因片段产生的β-半乳糖苷酶片段
是无活性的, 但它们可以通过α-互补作用在体内相互弥补, 即两部分产物可以结合形成有活性的β-半
乳糖苷酶。当pUC 质粒引入大肠杆菌中，在含有指示剂X-gal 和 IPTG 的诱导培养基上培养时，菌落
成蓝色。如果在MCS 插入外源DNA 片段（基因），破坏了lacZ’ 基因的功能（插入失活），不再产生
α-肽链，不能和宿主细胞产生的多肽片段形成有活性的β-半乳糖苷酶，形成的菌落是无(白)色的。因此，
根据这种β-半乳糖苷酶的显色反应，便可以检测出含有外源DNA 插入序列的重组体克隆。 9．自然界中具备理想条件的质粒载体为数不多，即使是ColE1 和pSCl01 这两个自然质粒也不尽如人
意，通常需要进行改造。请问质粒改造包括哪些基本内容?
答：基本内容包括：(1) 删除一些非必要的区段及对宿主有不良影响的区段；削减载体的分子质量，
使载体具有更大的容纳外源片段的能力。 (2) 加上易于选择或检测的标记。
(3) 限制性内切核酸酶的酶切位点的改造，便于外源基因插入到载体中的特定位置。 (4) 加上一些调控元件，有利于克隆基因的表达。 (5) 安全性改造，限定载体的宿主范围。 10．质粒制备的基本原理？
答：带有质粒的细菌细胞在SDS 作用下裂解，并在碱性条件下使DNA 变性。调节pH 值至中性时，
质粒DNA 首先复性，而细菌基因组DNA 不能复性而与SDS-蛋白质形成复合体，可以被离心沉淀除去。
上清液中的质粒DNA 分子可被酒精沉淀或其他方法沉淀纯化出来。
噬菌体载体
一、填空题
1．噬菌体之所以被选为基因工程载体，主要有两方面的原因：①它在细菌中能够大量繁殖，这样有利
于外源DNA 的扩增；②对某些噬菌体（如λ噬菌体）的遗传结构和功能研究的比较清楚，其大肠杆菌
宿主系统的遗传研究的比较详尽。
2．λ噬菌体基因组DNA 为 48.5 kb，根据λ噬菌体的包装能力，其包装DNA 限度为 37～51 kb，为
其本身基因组的75～105 % 。将野生型λ噬菌体的基因组DNA 改造成插入型载体，如λZAP II，
该载体的最小分子大小约为48.2kb，插入的外源片段最大不超过 10.2kb 。构建的λ取代型载体λ EMBL4，基因组大小为42.36kb，填充DNA 片段为14 kb，可容纳的外源DNA 分子最大为 23 kb 。
3．野生型的M13 不适合用作基因工程载体，主要原因是没有合适的限制性内切核酸酶识别位点和选 择标记。
4．黏粒(cosmid)是质粒—噬菌体杂合载体，它的复制子来自质粒，COS 位点序列来 自λ噬菌体 ，最
大的克隆片段达到 45 kb。
8．野生型的λ噬菌体DNA 不宜作为基因工程载体，原因是：① 分子质量大；② 酶的多切点；③ 无 选择标记 。
9．M13 单链噬菌体的复制分为三个阶段：① SS→RF ；② RF→RF ；③ RF→SS。
二、选择题(单选或多选)
1．限制性内切核酸酶EcoR I 在野生型的入噬菌体DNA 中有5 个切点，Hind III 有7 个切点，BamH I
也有5 个切点。调整这些酶切位点的数量，主要通过( A )。 A．体内突变 B．完全酶切后连接
C. 部分酶切 D．先用甲基化酶修饰后再酶切 2．pBluescript M13 载体在多克隆位点的两侧引入了T7 和T3 两个噬菌体的启动子，这样增加了该载体
的功能，下述四种功能中哪一种是不正确的? ( D )
A．可以对插入到多克隆位点的外源片段进行转录分析 B．利用这两个启动子的通用引物进行PCR 扩增
C．利用通用引物进行序列分析 D．利用这两个启动子进行定点突变
3．下面关于细菌人工染色体 (BAC) 的特征描述，除了( C )外都是正确的。 A．通过电激法将大质粒转化到大肠杆菌比酵母的转化率提高了10~100 倍 B．BAC 载体在细菌中以环形超螺旋状态存在，使分离操作起来相对容易 C．BAC 载体在大肠杆菌宿主保持高拷贝
D．克隆到BAC 载体上的外源片段可以直接进行测序以获得末端序列
4．以黏粒为载体转染受体菌后，平板上生长的菌落会出现大小不一、生长速度不一的现象，
其原因是 ( D )。
A．营养成分不足 B．重组后的质粒复制不稳定
C. 重组后的黏粒整合到宿主染色体上 D．重组体中插入片段的大小不同 5．黏粒（Cosmid）是一种人工构建的载体，( AB )。
A．它具有cos 位点，因而可进行体外包装 B．它具有质粒DNA 的复制特性 C．进入受体细胞后，可引起裂解反应 D．进入受体细胞后，可引起溶原化反应 6．黏粒 (cosmid) 质粒中，COS 位点的功能是 ( C )。
A．复制起点 B．限制酶切位点 C．参与包装进入病毒外壳 D．选择标记 E．用于筛选重组子
7．关于λ噬菌体，下列描述有误的是 ( C )。
A．既能高效感染大肠杆菌，又能高效感染枯草杆菌 B．在进入宿主细胞后，其DNA 呈双链环状分子
C. 改造成载体后，可携带23kb 以上的外源DNA 片段 D．重组的噬菌体易于筛选和储存
8．下列关于黏粒载体的描述不正确的是 ( D )。 A．是由λ噬菌体与质粒DNA 重组的载体
B．既有质粒的特性，又有噬菌体DNA 的特性(如可体外包装)
C．可插入大片段的外源DNA 片段 D．可像YAC 载体那样构建大片段的基因组文库
三、判断题
1．取代型载体 (replacement vector) 是指同一种限制性内切核酸酶在λDNA 中具有两个切点。外源
DNA 通__________过取代这两个切点间的片段被克隆。错误，不一定是同一种酶，取决于填充片段两端酶切 位点
2．现在最常用的pUC 载体是pUC18，它的分子质量小，具有多克隆位点和易于选择的分子标记，并
且是松弛型复制。另外，这种载体可在辅助质粒的帮助下合成单链DNA。错误，不能形成单链
3．λ噬菌体DNA 和M13 单链噬菌体DNA 在成熟前的DNA 复制都是用滚环模型。正确 4．M13 噬菌体每个世代裂解宿主后，可释放100 个子代噬菌体。错误，不裂解
5．以黏粒（Cosmid）为载体的重组体虽然在平板上生长的速度不同，但是转化子中插入片段的扩增量
是相同的。 错误，由于重组体在平板上生长速度不同，转化子中插入片段扩增量不同
四、问答题
1．λ噬菌体DNA 被包装到噬菌体的头部需要哪些基本条件？为什么？
答：①两个cos 位点；②线性DNA；③分子大小在λ噬菌体基因组的75%～105%。 2．为什么野生型的λ噬菌体DNA 不宜作为基因工程载体?
答：(1) 噬菌体DNA 没有容载能力，因为噬菌体的头部对DNA 包装的量是有限制的，不能大于
基因组的105％，所以要将λ噬菌体改造成载体，必须削减本身的分子大小； (2) 野生型的λDNA 对于一些常用的酶都有多个识别和切割位点，不便于克隆；