发布时间 : 星期三 文章牛奶和乳制品中唾液酸的测定 - 图文更新完毕开始阅读7f50a00402020740be1e9b7d
成长奶粉（Nestlé Excella Gold）作为一种模式样本母体，它的酸水解有乙酸水解（Hara和他的同事），硫酸氢钠水解（Anumula）和甲酸(0.5 M)三种水解方式，最终得到Neu5Ac和 Neu5Gc两种水解产物。这两种水解方式都是在80?C的条件下进行的（Fig.2）。同时，样本也可以在37?C，由两家不同公司提供的唾液酸酶（EC 3.2.1.18）的作用下进行水解（Fig.2）。其中的一项最重要发现也许就是Neu5Ac和 Neu5Gc所需的水解条件不同。比如说当使用硫酸氢钠进行水解时，Neu5Gc在30min后达到水解的最大值，而Neu5Ac在1.5h后才可以达到水解的最大值。另一方面，在甲酸或乙酸的水解条件下，Neu5Ac到达水解的最大值（分别2h和3h）要比Neu5Gc快，Neu5Gc在4h后仍达不到水解的最大值。
Fig.2:不同水解条件下婴儿配方奶粉的检测
尽管乙酸（2M）经常在文献中被提到用于水解反应（table2），但我们在研究中发现0.5M甲酸进行水解，样品有更高的回收率（Fig.2）。唾液酸酶水解释放的Neu5Ac与乙酸作用释放的量相似，不过，酶的价格较贵，并且难以掌握。同时，若用唾液酸酶，Neu5Gc的吸收峰会扭曲且不易被整合。目前干涉的来源和对它的判定还未搞清和解决，很可能是由于未知曲线造成的影响。Fig.2是酶的水解线，希望能对其做出适当的说明。
唾液乳糖也可由乙酸，甲酸和唾液酸酶进行水解。这样，通过唾液乳糖的水解量就可以很好的计算唾液酸的理论当量，因而可以对唾液酸的回收进行有效地估计。当用甲酸（0.5M，80?C）水解成长奶粉，1h后唾液酸的水解就达到了最大回收率，为88.2%，2h后则能达到释放的最大值。用甲酸水解2h后，回收率会稍有下降，为86.8%。当用乙酸进行水解（1.8 M, 3 h, 80 ?C），其回收率为85.5%。当使用唾液酸酶，1h后回收率就能达到88.0%，并且在4h内回收率都能维持稳定（更长的时间未进行研究）。当使用0.5M的甲酸去水解唾液乳糖，Neu5Ac的回收率可以和用乙酸和唾液酸酶进行水解相比。当水解成长奶粉时，与其他酸水解相比，使Neu5Gc和Neu5Ac的释放的最有效地方式是使用甲酸（0.5 M, 2 h, 80 ?C）水解，而同时其释放的唾液酸的量与酶水解释放的量相当。
使用50mM硫酸（1 h, 80 ?C）进行水解是另一种常用的水解唾液酸复合物的方法。这种水解方法在应用于成长奶粉样品和胎球蛋白时可以和用甲酸（2h，80?C）水解相比。Table4比较了两者的值。不过，在研究两种DMB标准唾液酸衍生物溶液的RF值时，使用硫酸的值要比使用甲酸的值低15%-20%，同时当使用硫酸时，会发现在Neu5Ac的附近有伴随峰。
Table4：唾液酸水解的比较
我们在甲酸（0.5 M, 2 h, 80 ?C）和硫酸（50 mM,1 h, 80 ?C）的水解条件下分别对游离唾液酸的降解进行了研究。同没有加热的溶液相比，在峰值区域两者分别损失6%，4%。这里的唾液酸降解的量要比以前报道过方法的降解的量略
低。不过，这些数字并不意味着处于结合糖状态（大部分样本中唾液酸的存在形式）的唾液酸就很稳定。因此，为了避免校正过度，这里我们不用在矫正曲线上补偿水解中的降解部分（假设结合状态的唾液酸比游离状态的唾液酸稳定）。 尽管用硫酸进行水解的结果和这些用甲酸进行水解的结果相似，同时还能减少水解的时间，但是用硫酸进行水解后在色谱图上会有一些微弱的干涉信号。因此最终为避免这些多余的信号，决定使用甲酸对样品进行水解。 <3>衍生条件的最优化：
一般，为了能简单直接的对不含生色团的碳水化合物进行检测，一般使用UV之类的液相色谱法。对碳水化合物较为有效和灵敏的分析方法是对其进行荧光标记。对唾液酸的检测，有以下几种衍生手段，包括过-O-苯酰化酌，用1,2-二胺-4,5-二甲氧基苯（DDB），4'-肼基-2-芪唑盐酸盐，邻苯二胺（OPD）或DMB进行标记。衍生化的最普遍方法就是使用DMB（一种与α-酮酸发生特异反应的化合物），这样能使唾液酸衍生出酞嗪酮。OPD也被认为是有效的衍生试剂，同时据现有的报道，使用它发生衍生反应所花费的时间比使用DMB短。虽然使用OPD进行水解的时间短，但是HPLC的对DMB的衍生物分离更优化，而用OPD进行衍生反应的唾液酸则不适合进行HPLC的分离。因此，虽然OPD在衍生反应方面有很多优点，并且可以在40min内完成反应，这种试剂却并没有继续研究下去。因此，我们选择DMB作为衍生试剂，同时对衍生反应的时间，温度，和与酸的耦合反应等方面进行优化。文献中（Table2），大部分DMB衍生的条件都相似，除了一些溶剂的浓度略有不同外，衍生反应都是在50?C到60?C的条件下进行的，通常反应的时间是2.5h左右。
注：除了中村和他的同事在100?C，很短的时间内进行唾液酸的衍生反应。不过，在他们发表的论文中，唾液酸并不是作为被分析物研究的（不是为了检测唾液酸的量），他们的目的是揭示各种衍生试剂的不同。
在对唾液酸进行的衍生反应中，Hara和他的同事通过唾液酸的一系列标准溶液和特定的反应条件研究了荧光反应强度的相对反应时间。他们发现在反应5h后，峰值依然在增加。Stanton和他的同事及Manzi和他的同事发现，如果将被标记的唾液酸置于4?CHPLC自动取样器的环境中储存，在分析时再进行注射，也会有相似的现象。Hara和他的同事发现若反应在很高的温度下进行，反应的速
度会变快。Fig.3中我们可以看到80?C下的反应状况，其中平行线（2.5 h, 50 ?C）是Hara和他的同事做的空白对照。对于Neu5Ac，反应在80?C，40-50min左右就能达到反应的最大值。不过，Neu5Gc有点不同，在研究时间内它并没有达到反应的最大值。因为Neu5Ac是牛奶（婴儿配方奶粉，成长奶粉）最丰富的唾液酸，所以通常对衍生反应的优化主要针对Neu5Ac。即使Hara和他的同事发现Neu5Ac在80?C下无法达到检测器的最大反应，但因为在这个温度下，衍生反应完成的最快，所以常使用这种条件。不过若要避免检出限的问题，则要在更低的温度下进行较长时间的反应。我们选择在80?C，50min用DMB做衍生反应试剂进行衍生反应（Hara和他的同事的方法）。我们使用的DMB是1年内在-20?C下储存于棕色离心管的200μlDMB（Reuter和Schauer的研究）。、
Fig.3：唾液酸的衍生反应
唾液酸的DMB衍生物的稳定性也在研究中。标准的Neu5Ac和Neu5Gc混合液照上述的方法进行衍生反应，在24h后注射141份它们的溶剂发现，尽管峰值不断地增加，但是最小值和最大值的相对标准偏差为0.5%时，它们之间相差2%。因此发生DMB衍生反应的唾液酸在4?C时相对来说较为稳定。同时一份试剂注射后，