发布时间 : 星期一 文章噬菌粒到噬菌体库的详细步骤更新完毕开始阅读80332e4ded630b1c58eeb53d
主要试剂
p8V5噬菌粒载体(AHymaxlnc)
LB氨苄青霉素培养基(1％蛋白胨，0，5％酵母提取物， 0.5％ NaCl，100ug/m1氨苄青霉素) BstⅪ限制性内切酶(New England biolabs)
10 × NEBuer 3缓冲液 (0.5m01/L Tris-HCl，25℃时调节其pH为7.9， 1mol/L NaCl， 100mm01/L MgCl2，10mmol/L二硫苏糖醇) 酚：氯仿(1：1)
TE缓冲液(10mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA，pH 8.0)
乙酸钾溶液(分别按10％、15％、 20％、25％质量体积比溶于2mmol/L EDTA溶液中，加溴化乙锭至终浓度为1ug/m1) Qiagen P1asmid Maxi Kit(Qiagen)
3mol/L乙酸钠溶液，25℃时调节其pH为5.4
TBE缓冲液 (0.089mol/L Tris-HCl， 0.089mol/L硼酸， 2mmol/L EDTA， pH 8.3) 8％聚丙烯酰胺/7mol/L尿素/TBE凝胶 2×Prep TBE-urea上样缓冲液 (Invitrogen)
BstⅪ、BsiHKAI限制性生内切酶(New England biOlabs)
5 X DNA聚合酶缓冲液(200mmol/l Tris-HCl，pH 7.5，100mmol/LMgCl2， 250mmol/LNaCl) DNA聚合酶2.0(sequenase) (Amet-Sham BiOSCiences)
脱氧核糖核苷酸三磷酸混合液(dNTP) (dNTP各为25mm01/L) Microspin S-200 HR柱(Amersham BiOSCience8)
10 X连接缓冲液(500mm01/L Tris-HCl， pH 7.8， 100mmol/L MgCl2，100mm01/L二硫苏糖醇，1mmol/L三磷酸腺苷，500/(g/m1BSA) T4DNA连接酶(NewEnglandBl01abs) E.coli MCl061 F’菌株(Aflyrllaxlnc)
superbroth培养基(3.5％蛋白胨，2％酵母提取物，0.5％NaCl，通过NaOH调节pH至7.5) SOC培养基(2％蛋白胨，0.5％酵母提取物，10mmol/LNaCl，2.5mmol/L KCl， 10mm01/L MgCl2，
10mm01/L MgSO4，20mm01/L葡萄糖) LB氨苄青霉素培养基 3mol/L乙酸钠
SOPamp/glu培养基[2％蛋白胨，1％酵母提取物，100mmol/LNaCl，15mmol/L K2HPO4，5mmol/L MgCl2， pH7.2，100ug/m1氨苄青霉素，0.2％(w/v)葡萄糖] LB培养基/15％甘油(体积分数) VSC-M13辅助噬菌体(Stratagene) 20％(w/v)阿拉伯糖 20mg/m1卡那霉素(Kan)
PEG/NaCl(20％聚乙二醇，PEG平均分子量8000，2.5mmol/LNaCl)
磷酸盐缓冲液(PBS) (0.137mmol/L NaCl， 3mmol/LNa2HPO4，L4mm01/L KH2PO4，27mmol/LKCl，25℃调节pH为7.4) SOP amp/glu培养基
主要设备
荧光氧化铝薄层层析板(J.T.Baker)
Microspin Sephadex G-25柱 (Aruer-Sham BiOSCiences) 电转化仪(E.coli pulser，BiORad) 13 ml离心管(Sarstedt)
实验步骤
1. 载体的准备
1) p8V5噬菌粒载体DNA提取及用BstⅪ限制性内切酶消化
a. 挑取单克隆MCl061p8V5菌株到5ml LB氨苄培养基中，于37℃振摇培养6～8小
时，将培养物加入到含有1L LB氨苄培养基的2.8LFernbach大型锥形瓶中，37℃振摇培养过夜。
b. 依照产品说明，用QiagenPlasmid Maxi柱提取双链噬菌粒质粒DNA，可得到约1mg双链噬菌粒载体DNA。
c. 将200ug p8V5DNA，40ul 10×NEBuffer 3缓冲液和20ul BstⅪ限制性内切酶(200单位)混合，调整终体积为400ul，于55℃酶切过夜。
d. 上述反应物用等体积的酚；氯仿抽提两次，再用氯仿抽提一次。
e. 抽提物中加入40ul 3mol/L乙酸钠溶液和880ul乙醇，以沉降DNA。于室温离心10分钟后，小心去除上清，DNA沉淀用40ul TE缓冲液重悬。 2) 乙酸钾梯度离心
a. 缓慢地按浓度递减逐层加入上述乙酸钾溶液各1ml于13mm×55mm异质同晶聚合物(polyallomer)超高速离心管中。小心在上层加入200ul消化过的p8V5，使用SW50.1转子于20℃28000g(48000r/min)离心3小时。
b. 在手提紫外灯下观察离心管中线性化DNA条带的位置。用注射器逐层吸出条带，用水饱和的丁醇抽提数次以除去溴化乙锭。
c. 将上述抽提物的水相与0.1倍体积的3mol/L乙酸钠溶液以及2倍体积的乙醇混合，室温离心10分钟以沉降DNA。小心除去上清后，沉淀用70％乙醇洗涤后重悬于TE缓冲液中。于260nm测定DNA溶液的吸光度值以确定DNA溶液的浓度。 2. 插入片段的准备
3. 连接插入片段与BstⅪ消化的p8V5载体 1) 连接反应
a. 在13m1离心管中混合下列物质： 20ug p8V5载体(经BstⅪ酶切和纯化)
1.25ug插入DNA片段(经BstⅪ、Bsi HKAI酶切和纯化) 200ul 10×连接缓冲液 4ul T4 DNA连接酶 加水至反应总体积为2m1
b. 于14℃孵育过夜。加入1/10体积的3mol/L乙酸钠溶液和2倍体积的乙醇。于
10000r/min转速(JA.20转子)下离心15分钟。除去上清，用400ul TE缓冲液将沉淀重悬。再加入1/10体积的3mol/L乙酸钠溶液和2倍体积的乙醇，离心后将沉淀用70％乙醇洗涤并干燥，再加入20ul TE缓冲液将连接后的DNA重悬。 2) 准备电感受态细胞
a. 培养E.coli MCl061 F菌株于1L superbroth培养基直至对数生长期中期(OD600＝0.5)。
b. 在冰上冷却培养物30分钟。于4℃、5000 r/min转速(JA.20转子)下离心细菌悬液15分钟。
c. 用1L冷水将细菌沉淀重悬。重复上面离心步骤，用0.5L冷水将细菌沉淀重悬。 d. 重复上面离心步骤，用10ml 10％甘油将细菌沉淀重悬。于4℃6000r/min转速下离心细菌悬液15分钟。
e. 用10％甘油重悬细菌沉淀，至终体积为2m1。按每管200/ul分装后先于干冰转移到-70℃冷冻保存。 3) 电转化
a. 准备4个转化反应，其中每个电转化杯中含有200ul细菌和5ul连接后的DNA，于2.5kV电压下电转化。转化后，立即将细菌转移到2m1 SOC培养基中，在无选择压的条件下于37℃培养1小时。
b. 将4个转化反应产物混合，并将取出少量产物以10倍递减稀释。将100ul 10-4-10-5，稀释液涂布于LB氨苄青霉素琼脂培养基平板上，根据菌落生长数计算转化的效率。剩余的转化反应产物加入到500m1 SOPamp/glu培养基中，于37℃振摇培养直至OD600值达到0.8。 c. 取100m1上述培养物，从库中生成噬菌体。剩余的细胞悬液于6000r/min转速下离心10分钟。
d. 用10m1LB培养基/15％甘油重悬细菌沉淀，将其转移到Nunc冻存管中，每管1m1，并将其于-70℃冷冻保存，以备将来扩增库之用。 4. 扩增与储存
1) 辅助噬菌体感染和pⅧ诱导产生
a. 按10:1感染重数加入VSC-M13辅助噬菌体（约1012空斑形成单位(pfu)）到100ml 已转化的细菌中。于37℃静置孵育30分钟。
b. 将上述培养物加入到一个含有500ml SOPamp/glu培养基的三角瓶中。加入0.6 m1
卡那霉素溶液和6ml 20％阿拉伯糖溶液。于37℃振摇培养过夜。 2) 收集扩增后的噬菌粒库
a. 于4℃ 12000g转速（对于JA-10转子为8000r/min）将上述过夜培养物离心。将上清转移到一个新的离心管中，并再次离心。
b. 将上清转移到另一个新的离心管中，加入0.2倍体积的PEG/NaCl以沉降噬菌体。充分混合后冰上静置1小时。
c. 于8000r/min离心15分钟将噬菌体沉降。小心将上清除去，用10ml PBS将噬菌体沉淀重悬。滴定噬菌体储液；滴定结果出来前，噬菌体悬液可在4℃短期保存24小时。若需要长期保存，可将噬菌体悬液以1000倍库当量，于-20℃分批冻存。