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基因工程复习汇总
首先建立基因组或cDNA文库，利用探针从文库中筛选目的克隆。 9. 分子克隆载体应具备哪些特点？（4分） (1) 在宿主细胞内必须能够自主复制（1分）
(2) 必须具备合适的酶切位点，供外源DNA片段插入，同时不影响其复制（1分） (3) 有一定的选择标记，用于筛选（1分） (4) 具有较高的拷贝数，便于载体的制备（1分） 10. 受体细胞选择的基本原则 便于重组DNA分子的导入 便于DNA分子的稳定存在 便于重组体筛选
遗传稳定性高,易于扩大培养 安全性高,无致病性 内源水解酶缺失或蛋白酶低 受体细胞遗传密码无偏性 较好的转译和加工机制 较大研究与应用价值
11、 cDNA文库和基因组文库的主要差别有哪些？（5分）
（1）基因组文库克隆的是任何基因，包括未知功能的DNA序列；cDNA文库克隆的是具有蛋白质产物的结构基因，包括调节基因。（2分）
（2）基因组文库克隆的是全部遗传信息，不受时空影响；cDNA文库克隆的是不完全的编码DNA序列，因它受发育和调控因子的影响。（1分）
（3）基因组文库中的编码基因是真实基因，含有内含子和外显子，而cDNA文库克隆的是不含内含子的功能基因。（2分）
12、分析比较琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的异同点？
答：同：①原理相同。琼脂糖、聚丙烯酰胺均为无反应活性的稳定支持介质，可降低对流运动，故使电场中的分子电泳迁移率仅与分子的摩擦系数成反比。在一定电场强度下，DNA分子的迁移率取决于核酸分子的大小和构象。 ②凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙大小；浓度越高，空隙越小，其分辨能力也就越强；反之，浓度降低，空隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。 异：琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为02.Kb-50Kb之间；而聚丙烯酰胺分辨DNA片段的范围为1-1000bp，分离小片段效果最好，分辨率极高，相差1bp的DNA也可分开。
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13、转基因与克隆的不同
将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰，这一技术称之为转基因技术.
科学家把人工遗传操作动物繁殖的过程叫克隆，这门生物技术叫克隆技术，其本身的含义是无性繁殖，即由同一个祖先细胞分裂繁殖而形成的纯细胞系，该细胞系中每个细胞的基因彼此相同。 克隆是对单体的复制，这和转基因有着很大的不同。转基因技术可以保持生物基因的多样性，而克隆却没有什么帮助，反而有一定的威胁。 三、论述题 1、cDNA文库的构建
（1）分离细胞总RNA , 纯化分离mRNA。
（2）以mRNA 为模板，在逆转录酶的催化下，合成cDNA 第一链，
（3）双链cDNA 的合成：（dG方法）cDNA第一链与mRNA模板分离之前，在第一链cDNA分子3′端加上一段oligo（dC）。通过碱性蔗糖梯度离心处理，使mRNA模板分子降解，回收全长的cDNA第一链。最后以互补的oligo（dG）序列作为引物引导第二链cDNA的合成 （4）将合成的双链DNA重组入载体，导入宿主(大肠杆菌)增殖
2、什么是基因组文库(genomic library)?构建基因组文库，涉及哪些基本过程?它同遗传学上的基因库有什么不同?
基因组文库是用基因工程的方法，人工构建的含有某一生物基因组DNA的各种片段 的克隆群。一般以改造的噬菌体DNA或黏粒作为载体，包括下列过程：(1)高分子量染色体DNA的制备；(2)体外重组连接；(3)包装蛋白的制备；(4)重组体的体外包装；(5)将重组DNA导人寄主细胞；(6)筛选。基因组文库同遗传学上所讲的基因库是完全不同的概念。基因库(gene pool)是指在进行有性生殖的某一群体中，能进行生殖的个体所含总的遗传信息。在基因组文库的构建中，由于使用的载体不同，分为噬菌体载体和黏粒载体构建的基因组文库、YAC文库、BAC文库等。
3、目的基因筛选的策略 1、核酸杂交筛选
原理：将基因文库的菌落或噬菌斑原位转移到尼龙膜或硝酸纤维素膜之后，进行裂解，释放DNA并且固定在膜上，利用特异的核酸探针进行筛选，根据碱基配对原则筛选到目的基因。 适用范围：
（1）目的基因序列已知，利用该基因作为探针筛选。
（2）“基因园”：目的基因序列未知，同源基因已知，利用同源基因序列制备探针筛选。 （3）寡核苷酸简并引物探针：对目的基因的表达产物的氨基酸序列有所了解，则可以从这些氨基酸序列倒过来推导出核酸的可能序列，合成寡核苷酸作为探针。
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2、抗体筛选
（1）适用范围：已有目的基因表达产物的特异性抗体，利用抗体筛选表达特异抗原的克隆。 （2）原理：将cDNA定向克隆到表达载体构建成表达文库，用能与目的基因表达产物特异结合的抗体与文库中能表达目的基因的克隆结合，再用标记的二抗与一抗结合，指示目的基因所在克隆。 3、功能结合法筛选
适用范围：已知目的基因表达产物的功能 （1）噬菌体显示法
噬菌体展示技术的原理 ：噬菌体展示技术是将外源DNA通过基因工程技术克隆到适当的噬菌体载体上，使外源DNA片段对应的表达产物融合在噬菌体的衣壳蛋白上形成融合蛋白，呈现在噬菌体表面。外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，而其编码基因作为噬菌体基因组中的一部分可通过噬菌体DNA序列测序出来。 （2）酵母单、双杂交法 酵母质粒有PGBT9和PGAD424。
酵母双杂合系统用于检测已知蛋白质之间的相互作用，还可用于蛋白质的功能域研究及未知蛋白编码基因的分离克隆等。
4、Southern杂交一般过程及影响杂交因素。 Southern杂交操作步骤:
(1) 用限制性内切酶酶切DNA, 经凝胶电泳分离各酶切片段； (2) 转膜：将DNA片段转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上； (3) 预杂交：封阻滤膜上非特异性位点； (4) 杂交：让探针与同源DNA片段特异性结合； (5) 洗脱：去除非特异性结合的探针； (6) 自显影检查目的DNA所在的位置。 Southern杂交影响因子
1）、目的DNA在总DNA中所占的比例 2）、探针的大小和标记效率 3）、转移到滤膜上的DNA量
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4）、探针与靶DNA的同源性
5、简单阐述差异显示PCR克隆基因的原理及其优缺点，有何应用？
主要原理：利用真核生物mRNA结尾处有POLY（A）结构，在其3`端设计象5`-T11GA样引物，该引物可与mRNA总数的十二分之一结合，从而使这部分基因得到逆转录，同时结合5`端的随机引物（20条10-mer），可以使不同长度的基因得到扩增。 优点：
简便、灵敏、高效、省时，能快速显示mRNA的组成。 所需的mRNA量少。
各样本mRNA的差异可同时进行比较。 扩出的cDNA可直接用于测序、文库筛选等。 缺点：
假阳性条带多，对低丰度的基因表达不容易检测。 工作量大。 无法定量研究。
扩出的条带往往是3`端比较短的UTR区的一段序列，提供的信息较少。
利用该技术，目前已有越来越多的差别表达基因得以分离和鉴定，在分子生物学和基因工程研究领域发挥了极大的作用。（P221） 6、抑制性差减杂交的原理与应用。
原理：SSH的核心技术是抑制性PCR，它是一种将检测子cDNA单链标准化步骤和消减杂交步骤结合为一体的技术。其中标准化步骤均等了检测子中的cDNA单链丰度，而消减杂交步骤去除了检测子和驱赶子之间的共同序列，使检测子和驱赶子之间不同的序列得到扩增。 应用：
? 基因突变体的研究：如基因的表达与不表达； ? 基因时空表达的研究：如根、茎、叶；
? 不同处理条件下的基因表达差异：如施肥与不施肥、光照与不光照。 3、克隆基因目的蛋白的表达的形式主要有哪些类型？
表达蛋白按溶解特性通常包括：不溶性蛋白和可溶性蛋白两类，具体包括如下几种结构形态：包涵体型蛋白、融合型蛋白、分泌型蛋白 7、Ti质粒介导转化的过程
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①根癌农杆菌对植物细胞的识别和附着②根癌农杆菌对植物信号物质的感受③根癌农杆菌Ti质粒上的vir基因以及染色体上操纵子的活化④ vir区基因被激活，virD基因编码的核酸内切酶分别将T-DNA的RB序列和LB序列切出单链切口，释放出T-DNA的单链线性拷贝，T-DNA复合体的产生⑤T-DNA复合体在RB序列的引导下定向地穿过农杆菌的细胞膜、细胞壁、进入植物细胞壁并整合到植物的染色体基因组中
8、什么叫转基因植物？植物转基因技术的基本路线主要包括哪些？
利用DNA重组技术，在离体条件下对不同生物的DNA进行加工，并按照人们的意愿和适当的载体重新组合，再将重组DNA转入生物体或细胞内，并使其在生物体内或细胞中表达的植物。 植物转基因技术的基本路线 分离目的基因
目的基因与恰当的载体DNA形成重组DNA 重组DNA的扩增 目的基因导入到受体细胞
筛选转化细胞，诱导产生转基因植株 转基因植株的大规模种植
2、外源基因导入植物的方法主要有哪些？
? 物理方法：电击法、基因枪法(biolistic)、显微注射法、微激光束法 ? 化学方法：PEG介导法、脂质体介导法 ? 生物学方法：农杆菌介导法、花粉管通道法 9、基因工程的应用：
医药业：疾病的预防;病的诊断;病的治疗
农业及食品工业: 提高作物抗性;良作物品质;长果实货架期;用农作物生产药物 畜牧业;工食品
环境: 环境检测;环境净化
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