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第34讲 无菌操作技术实践
最新考纲 1.微生物的分离和培养 2018·全国卷Ⅰ（37）、2018·全国卷Ⅱ（37）、 2.培养基对微生物的选择作用 2018·全国卷Ⅲ（37）、2017·全国卷Ⅰ（37）、 3.某种微生物数量的测定 2016·全国卷Ⅰ（39）、2016·全国卷Ⅲ（39） 4.微生物在其他方面的应用 考点一 微生物的培养和应用
1.培养基
（1）概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。 （2）营养组成：一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。此外，还需要满足微生物生长对pH、氧气以及特殊营养物质的要求。 （3）种类
①按照物理性质可分为液体培养基、固体培养基、半固体培养基。 ②按照成分的来源可分为天然培养基和合成培养基。 ③按照功能用途可分为选择培养基、鉴别培养基等。 2.无菌技术
（1）含义：在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。 （2）常用方法
全国卷考情
3.大肠杆菌的纯化培养
（1）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
计算→称量→溶化→灭菌→倒平板 （2）纯化大肠杆菌的方法
①纯化培养原理：想方设法在培养基上得到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的菌落，即可获得较纯的菌种。
②纯化大肠杆菌的关键步骤：接种。 ③常用的微生物接种方法有两种
a.平板划线法：是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。如图所示：
b.稀释涂布平板法：是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。 （3）菌种的保存方法
①对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法。 ②对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。
点悟：（1）用稀释涂布平板法统计样品中菌落的数目往往比实际数目“低”。这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。而显微计数法由于不能区分死菌与活菌，故所得数值可能比实际值“偏高”。
（2）平板划线法只适用于微生物的提纯，不适用于微生物的计数，并且在最后一次划线的末端处的菌种最纯。
下图中图1为“倒平板”相关操作，图2为微生物接种方法。请思考：
（1）请用文字和箭头写出图1中正确的倒平板操作流程。
提示 C→B→A→D
（2）图示B为何需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？为何需进行D操作？
提示 B操作是通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。D操作是平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
（3）图2中E、F依次利用何种方法进行接种？其接种工具依次是什么？其接种后效果图解应如图中a还是b？
提示 平板划线法 稀释涂布平板法 接种环 涂布器 E—a、F—b
微生物实验室培养及无菌操作技术
1.（2018·全国卷Ⅱ，37）[生物——选修1：生物技术实践]
在生产、生活和科研实践中，经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。回答下列问题： （1）在实验室中，玻璃和金属材质的实验器具 （填“可以”或“不可以”）放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。
（2）牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法，与煮沸消毒法相比，这两种方法的优点是____________________________________。
（3）密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒，其原因是紫外线能 。在照射前，适量喷洒 ，可强化消毒效果。
（4）水厂供应的自来水通常是经过 （填“氯气”“乙醇”或“高锰酸钾”）消毒的。 （5）某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是 。
解析 （1）在实验室中，能耐高温的、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿和金属材质的实验器具等可以放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。（2）巴氏消毒法或高温瞬时消毒法与煮沸消毒法相比，其优点表现为在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少。（3）紫外线照射能消毒的原因是其能够破坏微生物细胞中的DNA分子。在利用紫外线照射前，适量喷洒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液，可强化消毒效果。（4）自来水通常采用氯气消毒。（5）采用高压蒸汽灭
菌时，若压力达到设定要求，而温度未达到相应要求，最可能的原因是没有排尽高压蒸汽灭菌锅内的冷空气。
答案 （1）可以 （2）在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少 （3）破坏DNA结构 消毒液 （4）氯气 （5）未将锅内冷空气排尽
2.（2019·东北师大附中调研）大肠杆菌是遗传学和微生物学中经典的模式生物。科研人员要对大肠杆菌进行研究，首先要纯化大肠杆菌，请结合所学知识，回答下列问题： （1）纯化大肠杆菌首先需要制备 培养基。在大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条件外，还要考虑 、温度等条件。
（2）可以估算出样品中大肠杆菌密度的接种培养方法是 ，估算值一般比实际值偏 （填“大”或“小”）。
（3）滤膜法可计数水样中的大肠杆菌。将过滤过待测水样的滤膜紧贴在培养基上，这属于微生物培养中 操作。根据培养基的物理状态来分，该培养基属于 培养基。
（4）如图是大肠杆菌的纯化培养的一种方法，1→2→3→4→5表示操作顺序，培养后可观察到所需菌落的区域是 ，接种结束后将培养皿 放入恒温箱中培养。 解析 （1）纯化大肠杆菌首先需要制备牛肉膏蛋白胨固体培养基。大肠杆菌的培养过程中，除考虑营养条件外，还要考虑温度、酸碱度和渗透压等条件。（2）接种大肠杆菌最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法，其中可以估算出样品中大肠杆菌密度的是稀释涂布平板法。由于两个或两个以上细胞聚集在一起，观察到的往往是一个菌落，故估计数值一般偏小。（3）过滤过待测水样的滤膜紧贴在培养基上，是将样品中的大肠杆菌接种到培养基上，固体培养基适于计数。（4）图中5区域就可得到所需要的菌落。接种结束后要将平板倒置放入恒温箱中培养。
答案 （1）牛肉膏蛋白胨固体 渗透压（或酸碱度） （2）稀释涂布平板法 小 （3）接种 固体 （4）5 倒置
1.无菌技术