发布时间 : 星期一 文章细胞培养念珠菌污染处理方法更新完毕开始阅读882d90d784254b35eefd342f
一下也想不了那么多，具体的你再问吧。最好把你怎么操作的过程描述一遍，我们就好针对性的指出错误了。建议你把细胞室，好好清理一下，污染是这样的，出现一次就比较麻烦，千万别急。还有，你们的紫
外灯没有问题吧？
非常感谢楼上的回信，在操作中我也严格按照无菌要求去做，因为操作台是公用的，而其它同学很少染菌，我想主要问题应在我身上，但是又找不到主要原因。我一般是这样操作的：紫外照后，用酒精棉檫拭手部开始操作，基本步骤是吸培养液到方瓶，再在方瓶中吹打混合，按比例传代，有时吸管头部碰在培养瓶口，
有时吸管口棉花塞的太紧或太松不好用，有时原因都找不到，请各位指点。
戴手套试试巴
最好是涂片看看是什么菌？注意操作，吸管碰别处立即更换。污染是常有的事，也不必太给自己压力，熟
能生巧。
你的滴管吸管进培养液瓶和细胞培养瓶前要在酒精灯上仔细烤一下，滴管不要反复用。其实无菌操作第一重要的就是你的超净台是不是还能用，滤网要及时清洗的。其次就是瓶口、滴管、移液器操作是过火的是
否正确。还有一点很重要，手一定不能在任何瓶口上方经过！
从你操作的步骤来看，你的细胞应该是很好操作的。没看到你要用消化液，这就减少了污染的机会。你用的吸管是自己做的吗？经常练练，熟能生巧，时间长了，你就知道如何控制所塞的棉花量了。（用牙签或12号针头等工具来塞比较方便，塞完后用火将露出的部分烧掉再灭菌，这样就不会在上吸耳球的过程中，出现将棉花弄掉的情况），另外，你要勤剪指甲，不要戴首饰，吸管一周灭一次菌，不要没用完老用。
操作是导致污染的最主要原因
根据本人的经验，操作是导致细菌污染的最主要原因。
本人以前曾经在一个相当严格的实验室工作过，那里的细胞室的要求是按照外科手术室要求的，更衣，换鞋，洗手，酒精擦手，戴口罩、帽子，所有培养液中加双抗，所有细胞操作器械专用；每天紫外灯照射40
分钟后才允许进入。但是，就是这样的条件，操作不好，一样要污染。
现在本人工作的实验室要求比那个实验室差的天远地远，但是只要操作仔细了，一样可以把最难养的细胞养好。本人曾经参观过一些名人进行细胞操作，也就是换上拖鞋，连工作服都不换就进细胞室，细胞一样没有问题。所以，最主要的是：工作服，尤其是袖口，消毒情况如何，袖口是否能够扎紧。如果不能保证，不如索性把袖口挽起来，把手臂用酒精擦一遍（其实我本人连擦都懒得擦，一样没事）。操作时，滴管两头都要烧。还有一点很重要，就是滴管头在加液体的时候，不要深入瓶口太多。在倒培养液的时候，可以拿起培养瓶直接倒，但是注意要倒干净，瓶口沾的最后一滴液体千万不可回流倒瓶内。还有一些基本的问题，比如瓶口要多烧一会，怀疑滴管有污染就一定要换。一旦细胞出现污染的迹象了，就一定要扔掉。如果实在想挽救，可以用一些高档抗生素（医院里给病人加药后的药瓶，用无菌盐水涮涮就能用，浓度足够），
但要小心浓度太高细胞也会死亡。
对付霉菌通常用饱和的硫酸铜溶液，放在培养箱的装水盘中，细胞房的空调要用除湿的功能。如果不幸染
上，要用84液擦培养箱，再用75%酒精擦。
灭菌操作：
在无菌箱内每立方米用甲醛8—10毫升，高锰酸钾5克，熏蒸45分钟后接种
在无菌箱中每立方米用甲醛8－10毫升、高锰酸钾0.25千克，熏蒸45分钟后接种，栽培种接种量按每瓶
二级种接30－40袋为宜。
（一）常用消毒剂
现将常用的消毒药品及其配制、使用方法，介绍如下：
1． 35％甲醛水溶液（HCHO）：又名福尔马林，使蛋白质变性。用于培养室、无菌室的灭菌。 2．0.1％的升汞水（HgCL3）：能使蛋白质变性，抑制酶类。0.1％升汞配制方法是称取升汞0.1克， 用少许酒精溶解，再加水至100毫升即成。用于无菌箱、培养箱、培养皿四周表面以及手指的灭菌。 3．石炭酸（C6H5OH），5％浓度喷雾后，能使蛋白变性沉淀。石炭酸（苯酚）50毫升，加水950
毫升配成。用于 工作服、实验桌的灭菌。杀菌效果同升汞。
4．高锰酸钾（KMnO4）：氧化剂。0.1％浓度能使蛋白质与氨基酸氧化，失去酶的活性，用于消毒，
能抑制或杀死 杂菌。
5．乙醇（CH3CH3OH）：又称酒精。消毒以75％浓度的效果最好。它能使蛋白质脱水变性。高浓
度酒精会使蛋白质很快脱水凝固，消毒作用反而减弱。
6．新洁尔灭：0.25％新洁尔灭用于无菌箱、无菌室的灭菌。一般新洁尔灭5％原液50毫升；加水
950毫升配成。
7．漂白粉水：取漂白粉10克，加水140毫升配成。通常在使用前临时配制，静置1～2小时，取上
清液喷射，进 行室内消毒，每平方米用1升。
8．药皂：煤酚皂、硼酸皂等各种药皂的水溶液，均可用于器具、橡皮塞及手指的消毒。 9．2％硫酸铜溶液：用硫酸铜（胆矾）2克，加水至 100毫升加热溶解配成。用于床架、木架等各
种菌种架的消 毒。还可用5％硫酸铜溶液。
10．0.5％波尔多液：先用硫酸铜1斤，溶于100斤水， 再用石灰1斤，加水100斤。然后等量混
合起来即成。用于菌种架、段木的消毒。
11.多菌灵：用于杀灭真菌、半知茵。1：800倍拌料或 1：500倍喷洒均可。
（二）无菌箱及无菌室的消毒灭菌 无菌箱的消毒灭菌，可采取以下几种方法：
l．用甲醛和高锰酸钾混合熏蒸：一般每平方米需40％甲醛10毫升、高锰酸钾8毫升，进行熏蒸。使用时，先密闭门窗，量甲醛溶液盛入容器中、然后倒入量好的高锰酸钾，人员随之离开接种室，关紧房
门，熏蒸20—30分钟即可。
2．0.1％升汞水消毒：用0.1％升汞水浸过的纱布或海绵进行指擦，或用喷雾器喷雾灭菌，使箱内的上下左右都沾上升汞水，手也可用升汞水消毒，并把袖子卷起来。喷雾后 20～30分钟，箱内的杂菌和雾
滴一起落到箱底被杀死，内部的空气就变得很清洁。
3．紫外线照射灭菌：在无菌箱中装一支200伏、3O瓦的紫外线灯管；每次开20～30分钟，就能达
到空间杀菌的 目的。照射结束后，罩黑布半小时，以增强杀菌效果。
4．石炭酸喷雾：在每次接种之前，用5％石炭酸溶液喷雾，可促使空气中的微粒和杂菌沉降，防止
桌面微尘飞扬，并有杀菌作用。
5．石灰揩擦：经常用药物熏蒸，易造成酸性环境，特别用甲醛和高锰酸钾熏蒸长久，污染往往越来越严重，预防办法可把各种药品交替使用，过一段时间（约五周）用石灰擦洗一遍。实践证明，这样做效
果很好。
无菌室消毒同无菌箱。 （三）无菌室的使用规程
无菌室无固定程序，但按一般操作应遵循如下规程：
1．接种室内和缓冲室内使用前，用5％石炭酸溶液喷雾。把所需要的器材搬入缓冲室清洗，等晒干
后搬入接种 室，打开紫外线灯，照射杀菌。
2．穿上工作服及无菌工作帽、鞋，然后用煤皂液洗手2 分钟。进人接种室后，查验器械是否放在一定位置。然后用 5％石炭酸溶液重点在工作台的上方和附近的地面上喷雾。然后退回缓冲室。还可给接种
室门口地面洒一层石灰，进门时踩石灰可使鞋底保持无杂菌状态。
3．接种操作前，用70％的酒精棉球擦手。进行无菌操作时，要严格认真，动作轻捷，尽量减少空气
流动。
4．工作结束后，立即将台面收拾干净，不留残物。然后用5％石炭酸全面喷洒。
5．操作时，注意安全。如棉塞着火，用手紧握即可熄灭。如打破菌瓶，可用抹布沾5％石炭酸，收
拾到废物桶 内。每次的污染物应小心放在盘内，盖严拿出室外深埋或烧掉。
（四）无菌室空气污染情况的检验
定期检验无菌室空气污染情况，对改进灭菌措施，提高成品率是非常必要的。常用方法步骤如下： 1．平板检验法：用常规培养基，倒成平板，收入接种室。在事先熏蒸好的接种室，使用前半小时或1小时把供试的培养皿或试管打开，按预定时间盖好培养皿或试管。留对照皿不打开。然后一起放入30℃的温箱中培养48小时，检查有无菌殖生长，并由菌落形态，判断杂菌种类。一般要求平板培养基开盖5
分钟，菌落不超过3个；叙面培养基开塞 30分钟者，以不出现菌落为合格。
2．斜面检验法：将常用的琼脂斜面培养基各取二管， 放入接种室，按无菌操作各将其中的一管的棉塞取出，放在灭菌的培养皿内。经过一定时间后，再将棉塞通过火焰，塞回试管，连同对照一起培养。经
48小时后，检验无杂菌生长。和上边方法同。
3．空气污染情况检验：在接种过程中，人员的出过、器材的搬放、接种操作的动作等原因造成空气污染，检验方法是在准备工作结束后，接种操作开始时，按上述方法打开培养皿盖子或试管塞，经5分钟、
30分钟或直到工作结束时再盖好，以检验在不同的使用时间内，空气污染的程度。
如霉菌较多时；可先用5％石炭酸全面喷射后，再用甲醛熏蒸。如细菌较多时，可采取用乳酸和甲醛
交替熏蒸的办法加以杀灭。