发布时间 : 星期三 文章生物化学习题1 - 图文更新完毕开始阅读8de354c7bb4cf7ec4afed0d1
COO- CH2 N+H3 Pka2 COOCH2 - NH2 COO- +H+ COOHCHO CH2 N(CH2OH)2 - CH2
答案：先加入过量的甲醛，用标准氢氧化钠滴定时，由于甲醛与氨基酸的NH2作用形成-NH·CH2OH，-N（CH2OH）2等羟甲基衍生物，而降低了氨基的碱性，相对地增强了氨基的酸性解离，使pK减少2-3个pH单位。使滴定终止由pH12左右移至9附近，亦即达到酚酞指示剂的变色区域。
18、用lmol酸水解五肽，得2个Glu，1个Lys，用胰蛋白酶裂解成二个碎片，在pH=7时电泳，碎片之一移向阳极，另一向阴极；碎片之一用DNP水解得DNP一谷氨酸；用胰凝乳蛋白酶水解五肽产生两个二肽和一个游离的Glu，写出五肽顺序。
解析：
（1）lmol酸水解生成2个Glu，1个Lys，由于酸水解时，色氨酸，易遭到破坏，且天气酰胺和谷氨酰胺和谷按酰胺基常被水解，所以从回收的氨基酸情况可以推测该五肽的氨基酸组成为2Glx、2Trp、1Lys。
（2）用胰蛋白酶水解五肽，得到两个肽段，由于该酶专一性很强，它只断裂Lys或Arg的羧基参与形成的肽链，所以，Lys必定不是末端氨基酸，即?Lys?
（3）用胰凝乳蛋白酶水解原五肽生成两个肽段及游离的Glu，因为胰凝乳蛋白酶可水解Trp的羧基形成的肽键，所以可推知该肽的氨基酸序列为：X- Trp- Y-Trp-Glu。
（4）综合上面的推测可知该肽的序列为X- Trp-Lys-Trp-Glu。
（5）该肽与DNP作用水解生成DNP-Glu，而DNP一般来说是与N末端的-氨基发生反应的，所以说明该五肽为Glx-Trp-Lys-Trp-Glu。
（6）用胰蛋白酶水解五肽得两个肽段，即为Glx Trp Lys和Trp Glu，在pH7.0时电泳，Trp-Glu带负电荷，向阳极移动，根据题意Glx Trp Lys应向阴极移动，说明Glx是Gln而不是Glu。
综上所述，该五肽应为：Gln-Trp-Lys-Trp-Glu。
19、简述血红蛋白的结构及其结构与功能的关系。
答案：血红蛋白是一种寡聚蛋白质，由四个亚基组成，即2个α亚基和2个β亚基，每个亚基均有一个血红素，且有与氧结合的高亲和力，每个血红素都可以和一个氧分子结合。当四个亚基组成血红蛋白后，其结合氧的能力就会随着氧分压及其他因素的改变而改变。这种由于血红蛋白分子的构象可以生一定程度的变化，从而影响了血红蛋白与氧的结合能力。另外，血红蛋白分子上残基若
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NHCH2OH 发生变化，也会影响其功能的改变，如血红蛋白β-链中的N未端第六位上的谷氨酸若被缬氨酸取代，就会产生镰刀形红细胞贫血症，使红细胞不能正常携带氧。
20、列出蛋白质二级结构和超二级结构的基本类型。
答案：①天然蛋白质的二级结构主要有α-螺旋、β-折叠和β-转角；②超二级结构有三种基本组合形式：αα、βαβ和βββ。
21、根据蛋白质的理化性质，详细阐述蛋白质分离提纯的主要方法。
分离提纯某一特定蛋白质的一般程序可以分为前处理、粗分级和细分级在三步。
第一步是前处理（pretreatment）。分离提纯某一蛋白质，首先要求把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态，不丢失生物活性。为此，应根据不同的情况，选择适当的方法，将组织和细胞破碎。组织细胞破碎以后，选择适当的介质（一般用缓冲液）把所要的蛋白质提取出来。
第二步是粗分级（rough fractionation）当蛋白质混合物提取液获得后，选用一套适当的方法，将所要的蛋白质与其他杂蛋白质分离开业。一般这一步的分级用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。这些方法的特点是简便、处理量大，既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质溶液。
第三步是细分级（rine fractionation），也就是样品的进一步提纯。样品经粗分级以后，一般体积较小，杂蛋白大部分已被除去。进一步提纯，一般使用层析法包括凝胶过滤，离子交换层析，吸附层析以及亲和层析等。必要时还选择电泳法，包括区带电泳、等电聚焦等作为最后的提纯步骤。用于细分级的一般规模较小，但分辨率高。
结晶是蛋白质分离提纯的最后步骤。蛋白质纯度越高，溶液越浓就越容易得到结晶。
答案：蛋白质由氨基酸构成，一部分性质与氨基酸相同，如两性游离和等电点，某些呈色反应等。但蛋白质是由氨基酸借肽键构成的高分子化合物，又有不同于氨基酸的性质，易沉降、不易透过半透膜、变性、沉淀凝固等。通常可利用蛋白质的理化性质和生物学性质来纯化蛋白质。而分离纯化蛋白质又是研究单个蛋白质结构与功能的先决条件。
①蛋白质分子颗粒表面多为亲水基团，因而通过吸水分子形成一层消化膜，这是蛋白质胶体稳定的重要因素之一。盐析就是利用（NH4）2SO4、NaCl等中性盐破坏蛋白质的水化膜，使之从溶液中析出，使不同性质的蛋白质初步得到分离。②蛋白质分子量较大，不易通过半透膜，故可利用透析的方法将其与小分子化合物分开。人们常用透析法去除蛋白质溶液中的盐等小分子为进一步纯化作准备。③凝胶过层析法是一种根据各种蛋白质分子量的差异进行分离纯化蛋白质的方法。含有各种分子量的蛋白质溶液，在通过带有小孔的葡聚糖颗粒所填充的长柱时，大分子量蛋白质不能进入葡聚糖颗粒而直接流出，分子量小的蛋白质则进入颗粒而流出滞后，这样就将蛋白质分成不同分子量的若干组分。④蛋白质具有两性游离的特性，在某一pH条件下，蛋白质颗粒表面带有电荷，可利用电泳法和离子交换层析法将蛋白质离纯化。蛋白质被分离纯化后，可用于作一级结构及空间结构的分析。
22、牛血清蛋白质含Trp0.58%（重量比），已知Trp Mr=204，求该蛋白质最低
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相对分子质量。
解析：
因为Trp残基/牛血清蛋白Mr=0.58%，则有：蛋白质Mr=Try残基/0.58%，而Try Mr=204，所以有：蛋白质Mr=(204-18)/0.58%=32069。
23、请例举三种蛋白质分子量的测定方法，并简过其原理。
答案：测定蛋白质分子量的方法很多，例如渗透、扩散速率，沉降分析等，我们这里简单地介绍几种分子量的测定方法。
（1）沉降法：又叫超速离心法，蛋白质溶液经高速离心时，由于比重关系，蛋白质分子趋于下沉，沉降速度与蛋白质颗粒大小成正比，利用m=RTS/D(1-Vρ)即可求出其分子量m。
（2）凝胶过滤法：又称分子排阻层析或分子筛层析法，此法是在层析柱中装入葡聚糖凝胶，这种凝胶颗料中具有大量微孔，这些微孔只允许较小的分子进入胶粒，而大于胶粒微孔的分子则不能进入而被排阻。当用洗脱液洗脱时，被排阻的分子质量大的蛋白质先被洗脱下来，分子质量小的后下来，根据待测样品的洗脱体积可以求出其分子量。
（3）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法：蛋白质在SDS聚丙烯酰胺凝胶中电泳的速度取决于分子质量的大小，根据蛋白质分子在电泳中的相对迁移率和分子质量的对数成正比关系，可以求出蛋白质分子量。
24、凝胶过滤或分子筛层析是一种以蛋白质大小为基础的分离蛋白质的方法。蛋白质溶液放在填有高度水化的交联聚合材料（如Sephadex一交联葡聚糖）细珠的柱上。不同大小的蛋白质穿过水化细珠微孔的能力不同。较小的蛋白质要比较大的容易穿过微孔，因而较小的蛋白质过柱的速度要比较大的慢。
分离蛋白质的第二种技术是园盘电泳。它使蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶支柱物中受到电场的作用。在变性剂十二烷基硫酸钠[SDS：[CH3（CH2）]11SO4Na2]存在下进行电泳时，蛋白质分子按大小被分离开来，较小的分子移动得最快。（SDS可使蛋白质变性，并与它们进行非特异性结合，给出一个恒定的电荷质量比）。
这两种方法都是根据大小对蛋白质进行分级分离的。并且都使用交联聚合物作为支持介质。为什么在凝胶过程中小分子比大分子更易滞留，而在SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳中情况恰是相反？
答案：凝胶过滤是利用多孔材料的分子筛。每一个交联葡聚糖珠的交联基质都把大的蛋白质排阻在外，而允许小的蛋白质进入。因此，大的蛋白质必须在这些珠之间通过，也就是通过柱体积减去珠体积（此差值称这为空柱体积），小的蛋白质则通过总的柱体积。蛋白质颗粒越大，它在珠内所耗的时间越少，因此，洗脱得越快。
电泳用的聚丙烯酰胺凝胶是以单体丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺（交联剂）为材料，在催化剂的作用下，聚合成含酰胺基侧链的脂肪族长链，在相邻长链之间通过甲撑桥连接成三维网状结构物质。此三维网状结构物质相当于一个大的珠；这里没有珠之间的空隙，所有蛋白质必须通过交联基质。蛋白质越小，它通过交联基质则越容易，因此移动得越迅速。
25、将赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、酷氨酸和丙氨酸的混合物在高pH下放入阳离子交换树脂中，在用连续降低pH的洗脱剂洗脱，试预测它们的洗脱
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顺序。
查表可知，6种氨基酸pI的排列顺序是： Asp (2.98)(3.22)(5.66)(6.02)(9.74)(19.76) 它们△pH值的排列顺序为： Asp>Glu>Tyr>Ala>Lys>Arg 故它们被洗脱的先后顺序为： Asp Glu Tyr Ala Lys Arg 26、某一条肽经链酸水解组成分析含5种氨基酸，其N端非常容易环化。经CNBr处理后得一游离碱性氨基酸，Pauly反应阳性。若用胰蛋白酶作用则得两个肽段；其一为坂口反应阳性，另一个在280mm有强的光吸收，并呈Millon氏阳性反应。求此肽的氨基酸排列顺序，并指出它的等电点（pI）应该是大于、等于或小于pH7。 答案：其N端非常容易环化故是谷氨酸残基。因Pauly反应阳性，故表明有组氨酸或酪氨酸残基；而C端是个碱性残基，故这残基应是组氨酸。经CNBr处理后得一游离碱性氨基酸，因此，在C端的倒数第二位是一个甲硫氨酸残基。且胰蛋白酶作用得两个肽段：其一为坂口反应阳性，则说明肽链中间的一个碱性残基应是精氨酸残基；另一个肽段在280nm有强的光吸收，并呈Millon氏阳性反应，这提示了在精氨酸C端一侧的肽段中有酷氨酸。综上所述，这五肽的序列应是谷氨酰一精氨酰一酪氨酰一甲硫氨酰一组氨酸。这一肽段中有两个碱性残基，而酸性残基只有一个，因此，此肽段的等电点应大于7。 27、有人纯化了一个未知肽，其氨基酸组成为：Asp1，Ser1，Gly1，Ala1，Met1 Phel和lys2，又做了一系列分析，结果如下： （1）FDNB与之反应再酸水解后得DNP-Ala （2）胰凝乳蛋白酶（CT）消化后，从产物中分出一个纯四肽，其组成为：Asp1， Gly1，Lys1，Met1，此四肽的FDNB反应降解产物为DNP-Gly。 （3）胰蛋白酶（T）消化八肽后又可得到组成分别为Lys1，Alal，Serl及Phel， Lys1，Gly1的两个三肽及一个二肽。此二肽被CNBr处理后游离出自由天冬氨酸。 请列出八肽全顺序并简示你推知的过程。 答案：由结果（1）可得知此肽的N端是Ala；由结果（2）可知C端四肽的序列是Gly-Lys-Met-Asp；由结果（3）可知N端的三肽序列为Ala-Ser-Lys，中间的肽段序列为Phe-Gly-Lys，二肽被CNBr处理后游离出自由天接着氨酸，这提示了这二肽的序列为Met-Asp，而且没有碱性残基，因此是整个肽链的C端二肽。完整的八肽序列为：Ala-Ser-Lys-Phe-Gly-Lys-Met-Asp. T↓CT↓ T↓ Ala-Ser-Lys-Phe-Gly-Lys-Met-Asp DNP-Ala DNP-Gly 28、蛋白质化学研究中常用的试剂有下列一些CNBr，尿素，β巯基乙醇，胰蛋白酶，过甲酸，丹磺酰氯，6mol/L HCL，茚三酮，异硫氰酸苯酯和胰凝乳蛋白酶等。为完成下列各项试验，请回答每一项的最适试剂是什么？ 8