发布时间 : 星期五 文章流式细胞仪原理与应用更新完毕开始阅读8f59f17be87101f69e31959d
FCCL、MZL鉴别。
2． T/NK细胞系淋巴瘤 早期T细胞一般CD2、CD5、CD7、cCD3阳性。T/NK细胞系淋巴瘤的详细分类及表型参见表12.8。细胞膜CD3阳性可确认为外周T细胞肿瘤, 外周T细胞肿瘤的特征是CD3与CD4或CD8复合表达，并常有克隆性T细胞受体，或α-β型或γ-δ型；
MF（mycosis fungoides）--蕈样真菌病和sezary综合症:占皮肤淋巴瘤的绝大多数，CD4阳性，同时表达CD2、CD3、CD5，有时CD7阴性，CD8阳性病例极少见但已有报道，有无TCRβ基因重排对鉴别淋巴瘤和炎性反应有帮助。 LCL（large cell lymphoma）--大细胞淋巴瘤: 大细胞淋巴瘤（LCL）占成人淋巴瘤的40%，儿童的1/3，成人80%是B细胞型的，儿童B细胞型和T细胞型各占一半。
3． 淋巴细胞系以外的造血细胞肿瘤 急性髓系细胞白血病（特别是M4、M5）淋巴结转移时有发生，如T、B淋巴细胞标记低表达应怀疑并按白血病免疫分型处理。
4． 造血细胞以外的肿瘤 检测淋巴结、胸腹水标本时如遇CD45阴性情况应考虑非造血系统肿瘤淋巴结、胸膜、腹膜转移。 ? 血液学应用： 红细胞疾病诊断 （一）网织红细胞测定
计数外周血中网织红细胞数量,?对于评价骨髓红系造血及网织红细胞从骨髓到外周血的转送速率有重要意义。有核红细胞在成熟过程中,脱去细胞核后仍有少量RNA残留在细胞浆内,再经过约一天时间残留RNA完全消失,成为成熟红细胞。这种细胞浆内有残留RNA的红细胞称作网织红细胞。正常情况下有一定量的网织红细胞出现在外周血中,正常值为1.0～1.5%,上限3.0%,但当红细胞数异常时会出现错误结果。因此用网织红细胞绝对值表示,正常值5～15×1010/L。由于常规方法测定须先在体外经活体染色(最常用亚甲兰),然后在显微镜下计数,计数细胞数有限。用流式细胞仪测定网织红细胞具有以下优点:①可避免由于细胞核的碎片或铁幼粒细胞的颗粒的存在而出现假性网织红细胞升高②可避免人为误差③因为可在短时间内测量上万个细胞,结果较常规方法准确、可靠,?④同时可给出网织红细胞年龄结构。
流式细胞仪测定网织红细胞方法简单,?只须将红细胞洗净后用荧光染料染色后即可上机检测。常用的荧光染料有焦宁Y(Pyronin Y) 丫啶橙
(Acridine OrangeAO) ?碘化丙啶?(崐Propidium Iodine PI) 花青( Cyanine dye)等。
（二）PNH诊断
阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）因血细胞膜上锚固蛋白-糖磷酸肌醇（GPI）减少或缺乏而导致与GPI有关的补体激活抑制因子如CD55、CD59减少或缺乏，因而红细胞对补体异常敏感发生溶血。流式细胞仪检查CD55、CD59十分敏感，正常人CD55、CD59双阳性细胞>95%，PNH病人CD55、CD59明显减少，这种减少不仅表现在红细胞上，粒细胞、淋巴细胞也有减少。已发现CD55c可能对GPI减少或缺乏较CD59更敏感。
? 血液学应用： 血小板功能分析和血小板病诊断 （一） 血小板功能分析
血小板膜上有丰富的糖蛋白受体，是血小板发挥其功能的物质基础，静止期和活化期血小板的膜糖蛋白受体的种类、含量、结构和功能显著不同，用不同的抗血小板单克隆抗体可测定和分析血小板功能状态。血小板质膜糖蛋白单克隆抗体CD41(GPIIb/IIIa)、CD61(GPIIb/IIIa)、CD42b (GPIb)、CD41b (GPIIb)、血小板颗粒膜糖蛋白CD62p、CD63的测定可供分析血小板功能状态，如CD62p、CD63正常血小板不表达，当血小板活化时表达明显增加，可用来测定活化血小板。 （二）血小板病诊断攪
1．血小板相关抗体测定 血小板相关抗体可因不同机制产生。抗血小板自身抗体(包括原发性、药物诱导产生、合并其它自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮)能引起严重的血小板减少。大多数原发性(免疫性)血小板减少性紫癜病人血小板上和/或血清中有抗自身血小板的血小板相关抗体PAIgG、PAIgA、PAIgM。血小板相关抗体的抗原仍不十分清楚,可能有多种,如GPⅠb、GPⅡb 、GPⅢa、Pa、或?HLA抗原。?抗血小板自身抗体也可能发生于多次输血后或怀孕期间?,?这些自身抗体多为针对HLA-Ⅰ类抗原决定簇的抗体,一般是IgG,它们可迅速破坏和清除随机供血者的血小板。?因此能迅速测定这些抗体存在与否的方法是必需的。许多不同的利用放免、荧光、酶、?SPA等的测定血小板抗体的方法已建立,
但这些方法都很复杂、费时;同时给出的结果只能以一定量的血小板(105)中有多少抗血小板抗体来表示。近年来发展起来的用FCM测定血小板抗体的方法具有快速、简便的优点,同时可测定血小板上和血清中的抗体;测定中FCM?分析每一个血小板表面有无抗体,能给出血小板群体中有多少血小板表面有抗体(以%表示);?同时能给出血小板相关抗体量与血小板数的直方图,?使我们了解血小板相关抗体在血小板群体中的分布情况。
FCM测定血小板抗体原理:分别用标有荧光的抗人IgG、IgA、IgM或用抗血小板GPⅠb、Ⅱb、Ⅱb/Ⅲa的抗体与分离洗净的病人的血小板和在病人血清中孵育过的正常O?型血小板作用后用FCM测定,前者测定的是病人血小板上的抗体后者测定的是病人血清中的抗体。
2．血小板无力症 血小板无力症时血小板膜GPIIb/IIIa明显减少，用血小板质膜糖蛋白单克隆抗体CD41、CD61和流式细胞仪测定不仅可测出GPIIb/IIIa减少，CD42a、CD42b基本正常或偏高，还可测出GPIIb/IIIa减少程度，分类血小板无力症。
3.巨大血小板综合征（BSS）:血小板巨大, CD42a减少，CD42b减少，CD61 增加。
? 血液学应用：微小残留白血病检测
微小残留白血病(Minimal Residual Leukemia MRL)是指白血病经治疗后获得完全缓解(Complete Remisson CR)?后体内残留少量白血病细胞的状态。微小残留白血病与明显白血病(Overt leukemia)无明确界限,?仅是白血病细胞负荷数量不同,一般成人明显白血病时白血病细胞可达1012,经治疗获CR后≤1010,?因此MRL状态白血病细胞数可能是100-10攪。MRL是白血病复发的根源,因此检测MRL有十分重要的意义: ①指导临床治疗②预测白血病复发③评价自体骨髓移植的净化效果。应用FCM?检测MRL的优点在于可在短时间内分析大量标本,具有快速的特点。
由于白血病细胞缺乏特异性标记,FCM检测MRL的效果尚不理想,敏感性尚不够高，一般仅有1/103-104。目前主要有两类检测方法: ①用?FCM分析CR期骨髓细胞核酸量或染色体,可用于部分AL病人MRL分析,但敏感性仅1-5%。②免疫表型分析,由于尚无白血病特异的标记,只能通过与正常细胞比较某些抗原量
的差别及分布部位的不同作为检测依据;如利用TdT和CD10双标记检测MRL,但敏感性亦不高,约0.1-1%。
假阴性结果可能由于: ①标本中的白血病细胞＜10-4攪或＜10-5;②所取标本不能代表全身骨髓情况; ③病人白血病细胞表型转换。 ? 血液学应用：白细胞吞噬功能测定
粒、单核-巨噬细胞是机体免疫反应和免疫调节细胞中的重要成员。它们不仅具有吞噬功能,吞噬外来的微生物、肿瘤细胞等,同时又分泌多种生物因子参于免疫反应,此外单核-巨噬细胞对抗原物质的摄取、修饰、递呈等作用,是淋巴细胞的免疫功能必不可少的。因此检测白细胞吞噬功能对了解机体免疫状况有重要意义。以下简要介绍FCM?测定白细胞吞噬功能的概况。
应用光学显微镜、荧光显微镜测定白细胞吞噬功能时须分离粒、单核细胞, 并尽可能地保持细胞活性。用FCM检测时不须分离细胞,应用全血即可, 因此可在自然状态下测定?,结果准确可靠。
目标粒子一般以酵母、细菌等能激发自然吞噬作用或予先以抗体调理化的人造粒子为好;并标以荧光,常用者为FITC(异硫氰酸荧光素)或RA(罗达明). 以肝素或拘橼酸抗凝取外周血(避免用EDTA),200μl全血与目标粒子200μl(目标粒子浓度4×107/ml)置37°C温育,温育结束后立即置冰水中, 以同样标本不在37°C?温育而置于冰水中者作为对照。目标粒子不同温育时间不一,FITC标记的金黄色葡萄球菌25?分钟?,FITC标记的粒子15分钟即可达到吞噬饱和;此外,粒子与白细胞的比例也很重要,一般为10:1。温育结束后以溶血剂溶去红细胞即可上机检测。
应用FCM全血法测定白细胞吞噬功能,对白细胞的丢失、损伤最小;?此外用本法可测定血清中的调理素(Opsonine)水平及血清中有无吞噬作用抑制因子。如果用FITC标记的?单克隆抗体 CD13、CD14、CD15标记粒、单核细胞,用红荧光标记目标粒子,即可测定吞噬功能与细胞表面标记的关系,对白细胞吞噬功能作进一步的研究。
? 血液学应用：NK和LAK细胞活性测定
NK细胞存在于外周血大颗粒淋巴细胞中,它对靶细胞的细胞毒活性不依赖于抗体,无MHC限制性,它们的数量及细胞毒活性是机体免疫系统的重要指标。