发布时间 : 星期四 文章细胞生物学实验手册 - 图文更新完毕开始阅读8f7e3a74f46527d3240ce091
实验十一 细 胞 融 合
【实验目的】
掌握细胞融合原理、应用PEG融合细胞的方法以及细胞融合率的计算。 【实验用品】
一、材料 鸡红细胞
二、器材和仪器：显微镜、离心机、水浴箱、刻度离心管、试管、载玻璃片、盖玻片 三、试剂 50％PEG(MW4,000)、Hanks液(pH7.4) 【实验内容】 一、原理
细胞融合(Cell fusion)，即在自然条件下或用人工方法(生物的、物理的、化学的)使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的过程。人工诱导的细胞融合，在六十年代作为一门新兴技术而发展起来。由于它不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合，因此细胞融合技术目前被广泛应用于细胞生物学和医学研究的各个领域。 细胞融合的诱导物种类很多．常用的主要有灭活的仙台病毒(Sendai virus)，聚乙二醇(Polyethyleneglycol，PEG)和电脉冲。目前应用最广泛的是聚乙二醇，因为它易得、简便，且融合效果稳定。PEG的促融机制尚不完全清楚，它可能引起细胞膜中磷脂的酰键及极性基团发生结构重排。 二、方法
(1)取新鲜鸡血以0.85％生理盐水制成10％的悬液。
(2)称取0.5克PEG(MW=4,000)放入试管内，在酒精灯上融化之，迅速加入0.5ml预热的Hanks液混匀制成50％的PEG溶液。放入37℃水浴中待用。
(3)取上述10％的鸡红细胞悬液1ml放入离心管中，再加入5ml Hanks液混匀，然后以1,000rpm离心5分钟，小心弃去上清，用指弹法将细胞团块弹散。
(4)取上述50％PEG溶液0.5ml，在1分钟内滴加到鸡红细胞悬液，边加边轻轻摇动混匀。待PEG全部加入后静置1分钟左右。此全部过程都要求在37℃水浴内进行。 (5)缓慢滴加9ml Hanks液以终止PEG的作用，在37℃水浴内静置5分钟。 (6)离心弃上清后，取一滴融合后的细胞悬液滴片，加盖片镜检。 三、结果观察
在高倍镜下可以看到有两个或两个以上的鸡红细胞膜融合在一起，形成一个异核体细胞。要注意辨别融合细胞与重叠的鸡红细胞。 四、融合率的计算
在高倍镜下随机计数200个细胞(包括融合的与未融合的细胞)，以融合细胞(含两个或两个以上的细胞核的细胞)的细胞核数除以总细胞核数(包括融合与未融合的细胞核)即得出融合率。公式如下：
【作 业】
l．在显微镜下按顺序绘制所观察到的细胞融合各阶段，并注明主要特点。 2．你测定的细胞融合率为多少? (张之曾编)
实验十二 应用细胞融合技术制备染色体提前凝集
标本
【实验目的】
通过细胞融合技术，初步了解染色体提前凝集标本制备原理、方法及间期细胞三种时相的提前凝集染色体特点。 【实验用品】
一、材料 人宫颈癌上皮细胞(HeLa细胞)
二、器材和仪器 显微镜、离心机、水浴箱、热吹风机、10ml刻度离心管、5(1/2) 针头注射器、试管架、染色槽、废液缸、吸水纸、擦镜纸、冰冻载玻片、香柏油瓶、记号笔、酒精灯。
三、试剂 50％PEG、Hanks液(pH7.4)、RPMI一1640培养基(含10％灭活小牛血清，pH7.4)10μg／ml秋水仙素，0.075mol／L KCl低渗液、2％柠檬酸钠溶液、0.2％次甲基兰染液、1／15mol／L PBS、Carnoy固定液、Giemsa染液。 【实验内容】 一、原理
如实验十一所述，两个或两个以上的同种或不同种细胞可以在诱导物的作用下融合成一个细胞。
七十年代初，由于发现M期细胞内有某种促进染色体凝集因子，它无种属特异性，所以在细胞融合和染色体技术的基础上，建立了制备染色体提前凝集标本的方法。即让M期细胞与间期（I期）细胞融合，从而诱导I期细胞染色质提前浓缩成染色体。形成的这种染色体称提前凝集的染色体(Prematurely Condensed Chromosome，PCC)。这项技术已应用于细胞周期分析、正常细胞和肿瘤细胞染色体的微细结构的研究、多种因素作用细胞使染色体损伤及修复效应的研究，预测某种血液病的病程、愈后及复发的临床实践等方面。 二、方法
1．收集培养的M期HeLa细胞 取一瓶处于对数生长期的HeLa细胞，向培养基中加入10μg／ml的秋水仙素使终浓度为0.04μg／ml，在37℃二氧化碳培养箱内继续培养12小时，使大量生长的细胞被阻断于M期。每组取一瓶经上述处理的细胞，以平行于细胞生长面方向反复振摇，使培养液不断冲涮细胞层(或用吸管吹打)，M期细胞因变成球形容易脱离瓶壁而悬浮。将含有M期细胞的培养基移入离心管中，1000rpm离心5分钟，弃去上清加人5ml Hanks液，用吸管吹打成细胞悬液。 2．收集培养的HeLa细胞 取一瓶生长良好的HeLa细胞，弃去培养基。加入少量0.25％的胰蛋白酶消化2～3分钟，弃去胰酶消化液。然后加入5ml Hanks液。用吸管吹打成单个悬浮细胞备用。
3．50％PEG的制备
称取0.5g PEG(MW4,000)，倒入离心管中，在酒精灯上加热使之融化(约为0.5ml)，再加入预热的Hanks液0.5ml混匀，放在37℃水浴中待用。 4.细胞融合 (1)将上述l、2两管细胞倒入一个离心管中充分混匀。1000rpm离心5分钟，去掉上清，再小心地吸尽残液。
(2)用指弹法弹散细胞，在37℃水浴条件下吸取0.5ml 50％PEG，逐滴加入离心管内，并不断地轻轻摇动，整个过程约90秒钟。然后迅速加入5ml Hanks液以终止PEG的作用。在37℃水浴甲静置5分钟。
(3)1000rpm离心5分钟。弃去上清，加入2ml有血清的RPMI一1640培养基，同时用
针头的注射器垂直加入10μg／ml的秋水仙素1滴，轻轻吹打成悬液，37℃水浴中温育 30~60分钟。
5．制备PCC标本
细胞温育后，1000rpm离心5分钟弃去上清，加入10ml 0.075mol／L KCl低渗液轻轻制成悬液。在37℃处理25分钟左右；终止时加入lml Carnoy固定液进行固定，1000rpm离心8分钟，去掉上清，指弹离心管底部使细胞分散，加入10ml Carnoy固定液固定30分钟，1000rpm离心5分钟，弃去上清留0.2ml，用吸管轻轻吹打成悬液，取预冷的载玻片滴一张片，烤干后，Giemsa染色15分钟左右，水冲洗，干燥后镜检。 三、结果观察
在低倍镜下，可以容易地找到M期与I期细胞融合而诱导产生的PCC图像，由于处于I期不同时相的细胞均能与M期细胞融合而被诱导产生PCC，因此有三种不同形态特点的提前凝集染色体：G1期PCC、S期PCC和G2期PCC。其形态特点分别是： G1期PCC为单线染色体，细长，着色浅呈蓬松的线团状；S期PCC由于染色体解旋， DNA以多点进行复制，复制后的部分着色较深，以双线染色体片段形式存在，故呈粉碎颖粒状结构；G2期PCC因DNA复制完毕，所以可见凝集的双线染色体，但较M期染色体细长。
根据上述I期各时期PCC特点。在自己制备的标本中观察并分析各期PCC的图像。 【作 业】
根据PCC图像的观察，试说明对于理解细胞周期和DNA复制有什么启示? (张之曾 谢荣林编)
实验十三 培养细胞的形态观察和计数
【实验目的】
了解培养中的动物细胞的一般形态和生长状态；掌握细胞计数的基本方法。 【实验用品】
一、材料和标本 培养中的HeLa细胞(人子宫颈癌上皮细胞)、NIH3T3(小鼠成纤维细胞)、HL一60细胞(人白血病细胞)
二、器材和仪器 倒置显微镜、细胞计数板、普通光学显微镜、乳头吸管 三、试剂 0.3％台盼兰染液、0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液 【实验内容】
一、培养细胞的形态观察 (一)原理
体外培养的细胞主要有两种状态。一种是能贴附在培养支持物上的细胞，如HeLa细胞、NH3T3等，叫贴壁型细胞，体外培养的细胞绝大多数都属于这种细胞。另一种细胞并不贴附在容器的壁上，而是悬浮在培养液中生长，如HL—60，叫做悬浮型细胞，这类细胞主要是血液原性或癌原性的细胞。 (二)操作
l．将细胞培养瓶从37℃二氧化碳培养箱(或温箱)中取出，注意观察细胞培养液的颜色和清澈度。然后，将细胞培养瓶平稳地放在倒置显微镜载物台上，此时应注意不要将瓶翻转，也不要让瓶内的液体接触瓶塞或流出瓶口。
2．打开倒置镜光源，通过双筒目镜将视野调到合适的亮度。
3．调节载物台的高度进行对焦，在看到细胞层之后，再用细调节器将物像调清楚，注意观察细胞的轮廓、形状和内部结构。在观察时，最经常使用的是10X物镜。 (三)结果
贴壁细胞一般有两种形状，即上皮细胞形和成纤维细胞形细胞。上皮细胞形细胞呈扁平的不规则多角形，圆形核位于中央，生长时常彼此紧密连接成单层细胞片，如HeLa细胞。成纤维细胞形细胞形态与体内成纤维细胞形态相似，胞体呈梭形或不规则三角形，中央有圆核，胞质向外伸出2～3个长短不同的突起，细胞群常借原生质突连接成网，如 NIH3T3(参照照片)。
贴壁细胞在生长状态良好时，细胞内颗粒少，看不到有空泡，细胞边缘清楚，培养基内看不到悬浮的细胞和碎片，培养液清澈透明，而当细胞内颗粒较多，透明差，空泡多时，表明生长较差。当瓶内培养基混浊时，应想到细菌真菌污染的可能。悬浮细胞当边缘清楚，透明发亮时，生长较好；反之，则较差或已死亡。由于培养基内有pH指示剂的存在，因此它的颜色往往可以间接地表明细胞的生长状态。呈橙黄色时，细胞一般生长状态较好；呈淡黄色时，则可能是培养时问过长，营养不足，死亡细胞过多；如呈紫红色，则可能是细胞生长状态不好，或已死亡。实际上，一种细胞在培养中的形态并不是永恒不变的，它随营养、pH、生长周期而改变，但在比较稳定的条件下形态基本是一致的。在贴壁细胞培养中，镜下折光率高，圆而发亮的一般被认为是分裂期细胞。肿瘤细胞有重叠生长的特征。 二、培养细胞的计数及活细胞的鉴定 (一)在细胞生物学的实验中，往往要进行活细胞的鉴定和细胞的计数、调整细胞的密度，是进行实验必不可少的一种基本技能。