发布时间 : 星期四 文章细胞生物学实验手册 - 图文更新完毕开始阅读8f7e3a74f46527d3240ce091
图13—1 细胞计数板顶面观和侧面观的图示
图13—2 放大的计数室
(二)操作
1．将培养瓶中的培养液倒入干净试管中，向培养瓶中加入0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液lml,静置3～5分钟，待见到细胞变圆，彼此不连接为止。 2．将试管中的培养液倒回培养瓶中，并轻轻进行吹打，制成细胞悬液。
3．取细胞悬液0.5ml，加入0.3％台盼兰染液0.5ml，混合后染色3～5分钟。
4．滴加少许已染色的细胞悬液于放有盖片的细胞计数板的斜面上，使液体自然充满计数板小室。注意不要使小室内有气泡产生，否则要重新滴加。
5．在普通光镜10X物镜下计数四个大格内(如图13—1，13—2示)的细胞数，压线者数上不数下，数左不效右。 (三)结果
按下式进行细胞浓度的计数：
注① 4大格中的每一大格体积为0.1mm。1ml=l，0000大格，因此，1大格细胞数34
10=细胞数／ml。
3
注② 染色标本在15分钟内检查计数，因为台盼兰染液可以迅速地使死细胞染上蓝色，延长时间活细胞也将着色，用此方法来分辨死活细胞。
进行细胞计数时应力求准确，因此，在科学研究中，往往将计数板的两侧都滴加上细胞悬液，并同时滴加几块计数板(或反复滴加一块计数板几次)，最后取结果的平均值。
【作 业】
一、问题
下面是某些贴壁细胞培养数天后观察计数的结果：
瓶 培 养 基 镜 下 观 察 计 数 总 4 甲 乙 丙 丁
清澈度 颜 色 细胞界限 胞内颗粒 空泡 碎片 死 4 混蚀 黄 不清 多 多大 满视野 6310 5310 42 清 橙黄 清楚 少 少 无 9310 2310 64 清 黄 清楚 较多 有 有 2310 5310 44 清 紫红 不清 多 多 多 2310 1310 1．根据上表分析各瓶细胞的生长情况是：
A 细胞生长状态良好； B 培养时间太短； C 细胞污染可能性大； D 细胞与环境生长不适； E 细胞营养不足。
甲( ) 乙( ) 丙( ) 丁( ) 2．根据你的判断应采取的措施是： A 将细胞弃去；
B 立即换新鲜培养液； C 立即传代； D 放置继续观察； E 换到新的培养瓶中。
甲( ) 乙( ) 丙( ) 丁( ) 二、作图
将你观察到的培养细胞作一草图。 三、计算
将你计数的每毫升细胞悬液中的细胞总数，死、活细胞的百分比例计算出来。
(宁刚、毕卫真编)
实验十四 细胞的原代和传代培养
【实验目的】
初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程，为生物工程在医学上的应用打下基础。 【实验用品】
一、材料和标本 乳兔、HeLa细胞(人宫颈癌细胞)
二、器材和仪器 手术器械、平皿、培养瓶、吸管、离心管(灭菌后备用)、酒精灯、烧杯、超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜。 三、试剂 含有5％小牛血清的MEM培养液、0.01mol／L PBS，0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液、75％乙醇。 【实验内容】
一、原代细胞培养 (一)原理
细胞培养(Cell culture)是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。近年来，广泛地应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，发展成一种重要生物技术，并取得显著成就。由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养。原代培养细胞离体时间短，性状与体内相似，适用于研究。一般说来，幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养。 (二)操作 1．取材
用颈椎脱位法使乳兔迅速死亡。然后，把整个动物浸入盛有75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。用消过毒的剪刀剪开用碘酒和乙醇再次消毒后的皮肤，剖腹取出肝脏或肾脏。置于无菌平皿中。 2．切割
用灭菌的PBS液将取出的脏器清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直
3
到成1mm左右的小块，再用PBS清洗，洗到组织块发白为止。移入无菌离心管中，静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。 3．消化、接种培养
吸取0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液1ml，加入离心管中，与组织块混匀后，加上管口塞子，37℃水浴中消化8～10分钟，每隔几分钟摇动一下试管，使组织与消化液充分接触，静止，吸去上清，向离心管中加入5～10ml含5％小牛血清的MEM培养基，用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养。 (三)结果
细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长，如接种的细胞密度适宜，5天到一周即可形成单层。
二、传代细胞培养 (一)原理
体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过
大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或l:3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。
细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增不同。在一代中，细胞培增3～6次。细胞传代后，一般经过三个阶段：游离期、指数增生期和停止期。
常用细胞分裂指数表示细胞增殖的旺盛程度，即细胞群的分裂相数／100个细胞。一般细胞分裂指数介于0.2％～0.5％，肿瘤细胞可达3～5％。细胞接种2～3天分裂增殖旺盛，是活力最好时期，称指数增生期(对数生长期)，适宜进行各种试验。
(二)操作 1．将长成单层的原代培养细胞或HeLa细胞从二氧化碳培养箱中取出，在超净工作台中倒掉瓶内的培养液，加入少许消化液。(以液面盖住细胞为宜)，静置5～10分钟。
2.在倒置镜下观察被消化的细胞，如果细胞变园，相互之间不再连接成片，这时应立即 在超净台中将消化液倒掉，加入3～5ml新鲜培养液，吹打，制成细胞悬液。
3．将细胞悬液吸出2ml左右，加到另一个培养瓶中并向每个瓶中分别加3ml左右培养液，盖好瓶塞，送回二氧化碳培养箱中，继续进行培养。 (三)结果
一般情况，传代后的细胞在2小时左右就能附着在培养瓶壁上，2～4天就可在瓶内形成单层，需要再次进行传代。
三、器材及液体的准备和无菌操作的注意事项 (一)器材和液体的准备 细胞培养用的玻璃器材，如：培养瓶、吸管等在清洗干净以后，装在铝盒和铁筒中，120℃，2小时干烤灭菌后备用；手术器材、瓶塞、配制好的PBS液用灭菌锅15磅，20分钟蒸气灭菌；MEM培养液、小牛血清、消化液用G6滤器负压抽滤后备用。 (二)无菌操作中的注意事项 在无菌操作中，一定要保持工作区的无菌清洁。为此，在操作前要认真地洗手并用75％乙醇消毒。操作前20～30分钟起动超净台吹风。操作时，严禁说话，严禁用手直接拿无菌的物品，如瓶塞等，而要用器械，如止血钳、镊子等去拿。培养瓶要在超净台内才能打开瓶塞，打开之前用乙醇将瓶口消毒，打开后和加塞前瓶口都要在酒精灯上烧一下，打开瓶口后的操作全部都要在超净台内完成。操作完毕后，加上瓶塞，才能拿到超净台外。使用的吸管在从消毒的铁筒中取出后要手拿末端，将尖端在火上烧一下，戴上胶皮乳头，然后再去吸取液体。总之，在整个无菌操作过程中都应该在酒精灯的周围进行。 【作 业】
一、原代细胞和传代细胞培养有哪些区别?
二、总结一下你自己的经验，怎样才能既迅速，又保证无菌操作。
(宁刚 王维琴编)