发布时间 : 星期三 文章细胞生物学实验手册 - 图文更新完毕开始阅读8f7e3a74f46527d3240ce091
实验十五 酸性磷酸酶的显示
【实验目的】
了解Gomori硝酸铅改良法显示细胞内酸性磷酸酶的方法和原理 【实验用品】
一、材料 427细胞
二、器材 温箱、冰箱、显微镜、乳头吸管
三、试剂 冷丙酮或95％乙醇，Gomori硝酸铅作用液，2％甲基绿、1％硫化铵 【实验内容】 一、原理
酸性磷酸酶广泛存在于各种动物组织细胞，以前列腺、肝及脾含量最丰富。酸性磷酸酶在组织的退变过程中活性增强。在大部分组织中，它主要存在于溶酶体内，在溶酶体膜稳定完整时底物不易渗入溶酶体中，溶酶体内的酸性磷酸酶活力微弱或无活性。细胞经固定后，在合适的pH条件下，膜变得不稳定而改变其透性，底物渗透入溶酶体中，酶显现活力。故在研究溶酶体异常时有意义。
Gomori硝酸铅改良法是根据：以磷酸酯为底物，其被磷酸酶水解后释放出磷酸基，在 pH5左右和铅盐结合成磷酸铅盐，但磷酸铅无色，须经硫化铵作用使其变成棕黄色至棕黑色的硫化铅沉淀。 二、方法
1．将培养的427细胞在冷丙酮或95％乙醇中固定15～30分钟。 2．待片干燥。
3．移入已预热(37℃)的作用液中孵育2小时。 4．蒸馏水洗。
5．移入2％醋酸酸化1分钟，蒸馏水快速漂洗。 6．移入l％硫化铵1分钟，自来水漂洗数次。 7．必要时用甲基绿复染。
三、结果观察
酸性磷酸酶活性结构呈棕黄色至棕黑色。
对照：在处理过程中，在作用液中不加入甘油磷酸钠而加入蒸馏水，则呈阴性。 【作 业】
1． 绘出酸性磷酸酶显示镜下所见。
2．试说明酸性磷酸酶活性结构为何种细胞器? 讨 论 题
1．溶酶体分为几类?各有何特点?
2． 溶酶体是如何形成的?其标志酶是什么?如何在显微镜下显示? 3．溶酶体具有哪些功能? (张 婕 王维琴编)
实验十六 肿瘤细胞的软琼脂集落培养和测定
【实验目的】
初步掌握肿瘤细胞的软琼脂集落培养和测定方法，并了解药物对肿瘤细胞的诱导分化作用。
【实验用品】
一、材料和标本 HL—60细胞(人急性早幼粒细胞白血病细胞)。
二、器计和仪器 超净工作台、二氧化碳培养箱、显微镜、培养瓶、吸管、酒精灯、血细胞计数板、16mm的塑料多孔培养板(或35mm培养皿)。
三、试剂 含有15％～20％小牛血清的RPMIl640培养液、0.3％台盼兰、3％琼脂、二甲基亚砜(DMSO)。 【实验内容】 一、原理
在体外培养基中由一个祖先细胞增殖形成的细胞团，称之为集落。肿瘤细胞能无限繁殖，所以具有这种能力，而成熟分化的细胞则不能形成集落。HL一60细胞是一种急性早幼粒细胞白血病细胞，在体外无需加刺激因子，可在软琼脂培养基中形成集落。二甲基亚砜是一种细胞分化诱导剂，经二甲基亚砜处理后的HL一60细胞按粒系途径定向成熟分化，同时细胞的增殖力降低，几乎全部细胞丧失了软琼脂中形成集落的能力。因此，这种方法可用于细胞分化的基础研究和临床肿瘤治疗的疗效检验等方面。 二、操作
1．收集对数生长期的HL一60细胞，先按实验十三测定细胞活力，然后调整细胞浓度，制成300～1000活细胞／ml的细胞悬液。
2．取二个培养瓶每个瓶中加9ml调整好浓度的细胞悬液，然后各加入1ml3％琼脂(已融化，在65℃水浴中放置)，迅速加入，混匀。
3．用微量加样器吸140μl二甲基亚砜(MDSO)，加到一个瓶中，充分混匀，为实验组，另一瓶不加DMSO，为空白对照组。
4．取一个16mm多孔培养板，每孔加1ml(35mm培养皿需加2ml)细胞琼脂悬液，勿有气泡，将实验组和对照组分两组加好，盖上盖并作好标记。 5．在室温放置20分钟使细胞琼脂悬液凝固。 以上各步骤均在无菌条件下进行。
6．然后移培养板或平皿于CO2培养箱中37℃进行培养。 7．培养7～lO天，肉眼观察并计数细胞集落。 三、结果
以肉眼可见的细胞团(含500个以上细胞)作为计数集落的标准。对照组HL一60细胞在含0.3％的软琼脂培养基中生长良好,每个孔中可见有多个集落形成，而实验组HL一60细胞因经二甲基亚砜诱导分化，细胞在软琼脂中的集落形成明显减少。 四、集落的计数和计算
集落数=n孔中细胞集落数总和/n孔
集落形成率=集落数/接种培养细胞总数3100％ 【作 业】
1．分别计数实验组与对照组细胞集落数并算出它们的集落形成率。
2．上述的结果说明了什么问题?
(毕卫真编)
实验十七 电子显微镜生物标本的制备及观察
【实验目的】
了解电子显微镜的基本原理及电镜生物标本的制备方法和观察。 【实验用品】
一、材料和标本 家兔一只。
二、器材和仪器 H—600透射电子显微镜、S—450扫描电子显微镜、超薄切片机(AO型)、解剖镜、震荡器、恒温箱、临界点干燥器、JB一3型离子镀膜机、单面刀片、铜网、解剖器材。
三、试剂 乙醚、2.5％戊二醛(0.1mol／L(pH7.4)二甲砷酸钠缓冲液配制)、1％锇酸、30％、50％、70％乙醇溶液、80％、90％、95％、100％丙酮溶液、环氧树脂(Epon812)包埋剂、醋酸铀染液、柠檬酸铅染液、双蒸水、2％单宁酸、乙酸异戊脂、液态CO2。 【实验内容】
一、透射电子显微镜的标本制备及观察
(一)原理 电子显微镜是细胞生物学研究的重要工具，它以电子束为照明源，利用电子流具有波动的性质，在电磁场的作用下，电子改变前进轨迹，产生偏转、聚焦，因而电子束透过标本后在电磁透镜的作用下可放大成像。高速运动的电子流其波长远比光波波长短，所以电镜分辨率远比光镜高，可达0.14nm，放大倍率可达80万倍。由热阴极发射的电子在20～100千伏加速龟压作用下，经聚光镜聚焦成束，投射到很薄的标本上，并与标本中各种原子的核外电子发生碰撞，造成电子散射，在细胞质量和密度较大的部位，电子散射度强，成像较暗。在质量、密度较小处电子散射弱，成像较亮，结果在荧光屏上形成与细胞结构相应的黑白图像。
(二)主要结构 电子显微镜由电子光学系统、真空系统和供电系统三大部分组成(图17一l，图17—2)。
1．电子光学系统是电镜的主体，对成像和像的质量起着决定性作用。它是由电子枪、聚光镜、样品室、物镜、中间镜、投影镜、观察室和照像室等部分构成。
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2．真空系统主要是使镜筒内保持高度真空，一般要求达到10托（1托=lmmHg），是通过机械泵和油扩散泵接力排气及真空垫圈的密封作用来实现的。真空度可由真空表指示。由于电镜利用高速电子束为照明源，裁要求在电子束的通道上不能有游离气体存在，以免与气体分子碰撞引起电离、放电、电子散射、灯丝氧化、样品被污染等而影响观察效果或发生故障。
3．供电系统主要是提供稳定的电源，包括高压系统电源、各透镜的电源及真空泵的电源等。
(三)透射电镜生物标本超薄切片的制备(以家兔肝脏为例)。
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1．取材 取活兔用乙醚麻醉，迅速打开腹腔，暴露肝脏，用锋利的刀片切取lmm肝组织，立即投入固定液中。取材要求迅速，通常将动物麻醉取材。如动物处死后取材，要在几分钟内完成。取材最好在低温条件下进行(0～4℃)，以防止动物死后细胞缺氧发生超微结构变化。