发布时间 : 星期五 文章细胞生物学实验手册 - 图文更新完毕开始阅读8f7e3a74f46527d3240ce091
实验四 细胞中的微丝染色及微丝
与细胞形态的实验观察
【实验目的】
掌握微丝的染色方法，了解光学显微镜和电子显微镜下微丝的基本形态结构。 【实验用品】
一、材料和标本 盖片培养的成纤维细胞三片。
二、器材和仪器 光学显微镜一台、镊子一把、小平皿六个、载片三个、吸水纸、37℃恒温箱。
三、试剂 PBS(pH7.2)、2％Triton X—100液、M—缓冲液、3％戊二醛固定液、0.2％考马斯亮兰染液、100μg／ml的细胞松驰素B、DMEM培养液。 【实验内容】
一、成纤维细胞微丝的染色及其对细胞松驰素B的反应
(一)原理
微丝普遍存在于多种细胞，对细胞的形状和运动有一定作用。细胞松驰素B可与微丝的亚单位肌动蛋白结合，从而破坏微丝，改变细胞的形状。
(二)细胞松驰素B处理成纤维细胞与染色观察
1．在平皿中有三张成纤维细胞贴壁生长的盖片，在超净工作台内将一张盖片移入另一皿中继续培养，用作对照。
2．在有两片的平皿内加100μg／ml的细胞松弛素B 4滴继续培养半小时。 3. 将用细胞松弛素B处理过的两张盖片取一张做染色处理，另一张用培养液洗五次（在平皿内换五次培养液，每次都要摇动），继续培养、观察。两小时后细胞形状恢复，接近正常。
4．对恢复的盖片与第一张没用药的盖片一同做染色处理。
5．染色处理
①将需染色的盖片放入盛有PBS的平皿内用吸管轻轻吹洗盖片，换液三次，每次3分钟，洗去培养液。
②将盖片移入2％Triton X一100液，置37℃恒温箱内处理20～30分钟，以提取骨架以外的蛋白质，使骨架图像清晰。
③立刻将盖片移入M一缓冲液，换洗三次，每次3分钟。M一缓冲液有稳定细胞骨架的作用。
④将盖片移入3％戊二醛固定15分钟。
⑤将盖片移入0.2％考马斯亮兰染液中，染色15分钟。然后小心地用自来水冲洗，空气干燥。 (三)结果
光镜观察，微丝聚集成的张力纤维束被染成蓝色。在没用药的标本上，成纤维细胞多数有突起，微丝沿突起规则排列；用细胞松驰素B处理的标本，由于微丝被破坏突起缩回，多数细胞形状变圆；用药处理后又洗去药的标本，由于解除了药的作用，肌动蛋白重新聚台形成微丝，细胞形状恢复正常。
二、丽藻细胞内胞质环流及其对细胞松弛素B的反应 (一)原理
丽藻细胞大，整个细胞的中央为大液泡占据。靠近液泡是一层溶胶样流动的内质，在内质与质膜之间，为静止的外质，其中含有叶绿体。内质中含有许多颗粒，可以清楚地看到胞质环流。在丽藻细胞中的微丝与胞质环流有密切关系。成束的微丝出现在外质与内质接口(溶胶和凝胶接口)并交织一起，与环流方向平行。用细胞松弛素B处理后，就可抑制胞质的环流运动。 (二)方法
1．剪下一小块丽藻叶片(1～2cm)，置于载片上，盖上盖片。 2．观察（阳光充足时效果较好）。
3．再取一块丽藻叶片，滴一滴细胞松弛素B，10~15分钟后盖上盖片，观察。 4．洗去药物，再观察。 (三)结果
在丽藻内质中可以看到胞质环流，用细胞松弛素B处理后，胞质环流停止，洗去药物，又出现胞质环流。
三、微丝的电镜照片观察
恒河猴脊髓内神经纤维中微丝电镜照片，可见微丝是实心结构，直径5～8cm，它均匀地分散于细胞基质中，或排列成束和网状。 【作 业】
绘出三种不同情况下细胞中微丝的分布。 (时伟红编)
实验五 细胞器的光镜切片
和电镜照片观察
【实验目的】
观察除了实验二～五以外的其它细胞器在光学显微镜和电子显微镜下的基本形态结构。 【实验内容】
一、三种细胞器的光镜切片
（一）高尔基复合体(Golgi Complex)
用镀银法染色的豚鼠脊神经节光镜切片:神经细胞因合成运输大量的蛋白质而含有发达的内质网和高尔基复合体，在低倍镜下观察，神经节的假单极细胞体被神经束分隔成群。神经细胞的胞体呈圆形或椭圆形。转换高倍镜观察，细胞中央不着色的圆形区为细胞核。在核的周围有黑褐色颗粒状或呈不规则的条索状结构即为高尔基复合体。
图5一l神经节细胞(示高尔基复合体)
(二)尼氏小体(Nissl’s Body)
甲苯胺兰染色的牛脊髓涂片，尼氏小体即光镜下的粗面内质网。在低倍镜卡观察，染成蓝色的大三角形、星形细胞就是脊髓前角神经细胞，染色较深的小细胞为神经胶质细胞。转换高倍镜观察，可见脊髓前角神经细胞的细胞质中许多蓝色颗粒或网状结构即为尼氏小体。
图5—2 脊髓前角神经细胞的尼氏小体
(三)中心体(Centrosome)
铁苏木素染色的马蛔虫子宫切片，在低倍镜下观察可见许多受精卵细胞，细胞的外面有卵壳，细胞与卵壳之间的腔叫卵壳腔。在某些卵细胞内，于核附近有圆形的小粒——中心粒，它与周围致密的细胞质——中心球，组成中心体。转换高倍镜观察，可见中心体的外围还有星状的放射细丝即星体。
染色体中心体
图5—3马蛔虫受精卵细胞、分裂中期(示中心体)
二、六种细胞器的电镜照片
（一）高尔基复合体(Golgi Complex)
人体胃粘膜细胞高尔基复合体电镜照片：细胞质中有散在的高尔基复合体，其结构要由三部分组成：扁平囊、大囊泡和小囊泡，它们共同构成紧密重叠的囊泡结构。扁平囊约3～8层，它们平行排列，略弯曲成弓形。凸出的一侧为形成面，可见许多小囊泡，凹入的一侧为成熟面，可见扁平囊末端呈球形膨大，在分泌细胞中膨大部分不断脱离扁平囊，形成分泌泡。
(二)内质网(Endoplasmic Reticulum) 人胃壁细胞、恒河猴脊髓前角运动神经细胞粗面内质网电镜照片：粗面内质网在分泌蛋白质的细胞中较发达，在细胞核周围可见有较密集的膜层结构即为粗面内质网，它们大都呈片状排列，粗面内质网可与细胞核膜相通连。在粗面内质网的膜外表面附着许多小颗粒，即核糖体。
人胃粘膜盐酸细胞、小鼠睾丸间质细胞滑面内质网电镜照片：盐酸细胞分泌盐酸，细胞中密集的圆泡，无核糖体附着即滑面内质网，参加盐酸的合成。小鼠睾丸间质细胞中含有丰富的分支管状滑面内质网，合成固醇类的雄激素。 (三)中心粒(Centriole)
白血病细胞的中心粒电镜照片：中心粒是相互垂直的两个短筒状小体，从横切面看，每个短简由9组三联体微管组成。 (四)溶酶体(Lysosome)
小鼠肝细胞、人胃癌细胞溶酶体电镜照片：溶酶体为一层单位膜包围的囊状结构。溶酶体呈球形，质地均匀，吞噬性溶酶体依结合物不同而呈不同形态，溶酶体主要含酸性水解酶。 (五)核糖体(Ribosome)
小鼠肾细胞核糖体电镜照片：核糖体是由核糖核酸和蛋白质构成的大小亚基组成的椭圆形颗粒，附着于内质网上的称附着核糖体，此外还有散在于细胞质中的游离核糖体，而多个核糖体由mRNA串连在一起叫多聚核糖体。 (六)细胞核(Cell Nucleus)
豚鼠肝细胞核、人胃癌细胞核电镜照片：可见核膜由双层单位膜构成。内外核膜相距一定的距离结合形成核孔。核膜外层也附着核糖体并与内质网相通。 核中的海绵状球形结构就是核仁，它由纤维和颗粒构成。
在核膜内面和核仁四周，着色较深的为异染色质，其余着色较浅的是常染色质。 三、观察恒河猴脊髓前角运动细胞的电镜照片，总结细胞的超微结构 照片中是一个多角形的脊髓前角运动细胞，细胞表面以非常细的线条与周围分界，就是细胞膜。中央有圆形的细胞核，核膜密布核孔，核膜内侧少量着色深而致密的是异染色质，色浅的是常染色质。核中央海绵状的一团深色结构是核仁。细胞膜与核膜之间为细胞质。其