发布时间 : 星期六 文章细胞生物学实验手册 - 图文更新完毕开始阅读8f7e3a74f46527d3240ce091
实验八 细胞核与线粒体的分级分离
【实验目的】
通过细胞匀浆和离心的方法分级分离细胞的组分，以了解其原理及过程。 【实验用品】
一、材料和标本 小白鼠、冰块。 二、器材和仪器 玻璃匀浆器、普通离心机、台式高速离心机、普通天平、光学显微镜、载玻片、盖玻片、刻度离心管、高速离心管、滴管、10ml量筒、25ml烧杯、玻璃漏斗、解剖剪、镊子、吸水纸、纱布、螬盘、平皿、牙签。
三、试剂 0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液、1％甲苯胺兰染液、0.02％詹纳斯绿B染液、0.9％NaCl溶液。 【实验内容】 一、原理
细胞内不同结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。 分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离，其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的主要手段。
匀浆(Homogenization)低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质(即0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙)进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。
分级分离(Fractionation)由低速到高速离心逐渐沉降。先用低速使较大的颗粒沉淀，再用较高的转速，将浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中，所以每级离心得到的第一次沈淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化。
分析 分级分离得到的组分，可用细胞化学和生化方法进行形态和功能鉴定。 二、细胞核的分离提取 (一)操作步骤 1．用颈椎脱位的方法处死小白鼠后，迅速剖开腹部取出肝脏，剪成小块(去除结缔组织)尽快置于盛有0.9％NaCl的烧杯中，反复洗涤，尽量除去血污，用滤纸吸去表面的液体。 2．将湿重约1g的肝组织放在小平皿中，用量筒量取8ml预冷的0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液，先加少量该溶液于平皿中，尽量剪碎肝组织后，再全部加入。 3．剪碎的肝组织倒入匀浆管中，使匀浆器下端浸入盛有冰块的器皿中，左手持之，右手将匀浆捣杆垂直插入管中，上下转动研磨3～5次，用3层纱布过滤匀浆液于离心管中，然后制备一张涂片①，做好标记，自然干燥。
4．将装有滤液的离心管配平后，放入普通离心机，以2500rpm，离心15分钟；(1)缓缓取上清液，移入高速离心管中，保存于有冰块的烧杯中，待分离线粒体用；(2)同时涂一张上清液片②做好标记，自然干燥；(3)余下的沉淀物进行下一步骤。
5．用6ml0.25mol/L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液悬浮沉淀物，以2500rpm离心15分钟弃上清，将残留液体用吸管吹打成悬液，滴一滴于干净的载玻片上，涂片③，自然干燥。
6．将①、②、③涂片用l％甲苯胺兰染色后盖片即可观察。 (二)结果
分别于高倍镜下观察三张涂片，描述镜下所见。 三、高速离心分离提取线粒体 (一)操作步骤
1．将装有上清液的高速离心管，从装有冰块的烧杯中取出，配平后，以17000rpm离心20分钟，弃上清，留取沉淀物。 2．加入0．25mol／L蔗糖一0．003mol／L氯化钙液lml，用吸管吹打成悬液，以17000rpm离心20分钟，将上清吸入另一试管中，留取沉淀物，加入0.1ml 0．25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液混匀成悬液(可用牙签)。
3．取上清液和沉淀物悬液，分别滴一滴于干净载玻片上(分别标记④、⑤涂片)，各滴一滴0.02％詹纳斯绿B染液盖上盖片染20分钟。 (二)结果
油镜下观察，颗粒状的线粒体被詹纳斯绿B染成蓝绿色。 【作 业】
1．简要说明分级分离细胞的原理及意义。
2．比较一下分离细胞核时涂片①、②、③有什么不同?涂片③在你的实验结果中纯度如何？
2． 描述一下涂片⑤所见结果。
小白鼠
脱颈椎处死，迅速开腹
剪取肝组织
0.9％NaCl洗涤，称1g剪碎加8ml预冷的0．25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液
匀 浆
过滤，滤液移入离心管，滤
液涂片①
离 心 普通离心机2500rpm，15分钟
滴片 滴片
詹纳斯绿B染 詹纳斯绿B染 色④盖片 色⑤盖片
镜检 油镜检
图8—1 细胞核和线粒体分离图解
(朱亚勤编)
实验九 细胞分裂的形态观察
【实验目的】
通过标本制备和观察了解生物体细胞的无丝分裂、有丝分裂形态特征及生殖细胞的减数分裂过程。 【实验用品】
一、材料和标本 蛙血涂片、马蛔虫子宫切片和洋葱根尖切片、固定的蝗虫精巢。 二、器材和仪器 显微镜、擦镜纸、解剖针、眼科镊子、载玻片、盖玻片、吸水纸、培养皿、冰箱。
三、试剂 Carnoy固定液、70％乙醇、醋酸洋红染液、45％醋酸、二甲苯。 【实验内容】
细胞分裂对生物的个体发育和生存，对种族绵延有着十分重要的意义，高等生物体内细胞的分裂方式有三种：无丝分裂、有丝分裂和减数分裂。 一、动物细胞无丝分裂的观察一蛙血涂片 (一)原理
无丝分裂不仅是原核生物增殖的方式，而且雷马克(Remak)于1841年最早在鸡胚血细胞中也发现此现象，因为此过程没有出现纺锤丝和染色体的变化，故称无丝分裂(Ami— tosis)。其后无丝分裂又在各种动植物中陆续发现，尤其在分裂旺盛的细胞中更多见，但遗传物质平均分配否?及其分裂的机制尚不十分清楚。
蛙红细胞体积较大、数多，而且有核，是观察无丝分裂的较好材料。 (二)观察与结果
在高倍镜下，可见到处于不同阶段分裂过程中的蛙红细胞，核仁先行分裂，向核的两端移动，细胞核伸长呈杆状；进而，在核的中部从一面或两面向内凹陷，使核成肾形或哑铃形改变；最后，从细胞中部直接收缩成两个相似的子细胞；子细胞较成熟的红细胞小。 二、细胞有丝分裂的观察一马蛔虫子宫切片、洋葱根尖切片 (一)原理
细胞有丝分裂(Mitosis)的现象是分别由弗勒明(Flemming，1882)在动物细胞和施特拉斯布格(Strasburger，1880)在植物细胞中发现。有丝分裂过程包括一系列复杂的核变化，染包体和纺锤体的出现，以及它们平均分配到每个子细胞的过程。
马蛔虫受精卵细胞中只有6条染色体，而洋葱体细胞的染色体为16条，因为它们都具有染色体数目少的特点，所以便于观察和分析。 (二)观察
1．动物细胞有丝分裂的观察——马蛔虫子宫切片
取马蛔虫的子宫切片标本，先在低倍镜下观察，可见马蛔虫子宫腔内有许多椭圆形的受精卵细胞，它们均处在不同的细胞时相。每个卵细胞都包在卵壳之中，卵壳与卵细胞之间的腔，叫卵壳腔。细胞膜的外面或卵壳的内面可见有极体附着。寻找和观察处于分裂间期和有丝分裂不同时期的细胞形态变化，并转换高倍镜仔细观察。