发布时间 : 星期二 文章细胞生物学实验手册 - 图文更新完毕开始阅读8f7e3a74f46527d3240ce091
实验十 正常细胞与肿瘤细胞常规核型的标本制备
【实验目的】
掌握微量全血培养及正常细胞和肿瘤细胞常规核型的标本制备技术。了解正常及肿瘤细胞核型的一般特征。 【实验用品】
一、材料和标本 健康人的外周血、培养的HeLa细胞和HL—60细胞。
二、器材和仪器 超净台、煤气灯、乳胶管、火柴、镊子、废液缸、离心机、水浴箱、定时钟、天平、离心管(10m1)、乳头吸管、显微镜、载玻片、平皿等。无菌器材有培养瓶、培养皿、注射器(5ml、lml)、注射针头(7号、 号)、刻度移液管(5ml、2ml、lml)、吸管等。 三、试剂 1640培养液、500单位／ml的肝素溶液、10μg／ml的秋水仙素溶液、0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液,O．5mg／ml的PHA溶液、0.075mol／L的KCl溶液，甲醇、冰醋酸、Giemsa原液、磷酸缓冲液(pH6.8)、生理盐水等。 【实验内容】
一、微量全血培养 (一)原理
人体外周血中淋巴细胞是成熟的免疫细胞，正常情况下处于G。期不再增殖。PHA(Phytohemagglutinin，植物血凝素)是人和其它动物淋巴细胞的有丝分裂刺激剂，它能使处于G0期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞，进入细胞周期开始旺盛的有丝分裂。
人体微量全血培养是一种简单的淋巴细胞培养方法。此法采血量少、操作简便，在 PHA作用下进行短期培养即可获丰富的、有丝分裂活跃的淋巴母细胞，适于制备核型标本。各种因素的效应(如病毒、电离辐射、化学药剂等)也可在淋巴细胞的培养条件下进行观察，从而进行多种在体内无法进行的研究。因此它是细胞生物学及其它学科研究中的一种有效的方法。
(二)操作
1．打开超净台紫外灯20～30分钟。洗手、换洁净白大衣后进入操作室。启动超净台，点燃煤气灯。用75％酒精棉球擦洗手、各种试剂瓶及操作台面，然后将培养液及肝素、秋水仙素、PHA等所需溶液移入超净台。
2．在超净台内将每个培养瓶装入5ml培养液及0.2ml PHA溶液，封好备用。
3．用5ml注射器，7号针头，先吸取少许肝素湿润针筒，然后从肘静脉抽血l～2ml。 每个培养瓶接种全血O．2ml左右轻轻摇动使血和培养液混匀。
4．在培养瓶上标记好供血者姓名、性别、采血日期等，放入培养箱中37℃培养。每天轻轻震荡培养瓶二、三次，防止血球沉积并保证血细胞与培养液充分接触，促进细胞生长繁殖。
二、人淋巴细胞染色体标本制备 (一)原理
在淋巴母细胞分裂高峰时加入秋水仙素，破坏细胞纺锤体的形成，使细胞停止在分裂中期。然后收集细胞，低渗处理，使细胞胀大，染色体伸展。接着进行固定并除去中期分裂相中残存的蛋白质，使染色体清晰且分散良好。再结合离心技术去掉红细胞碎片，然后采用空气干燥法制片获得中期染色体标本。
(二)操作 1．微量全血细胞培养至68小时左右，用1ml注射器 号针头向每个5ml培养瓶内加2滴秋水仙素溶液，摇匀后继续培养3小时，此项操作不需要严格无菌。
2．按时终止培养，用吸管温和吹打成细胞悬液后，移至10ml离心管中。用天平平衡后以1000rpm离心8分钟，弃大部上清，剩0.5ml。再吹打成细胞悬液，加入预热37℃的 0.075mol／L的KCL溶液9ml，置37℃水浴中低渗处理30分钟(这期间配制3:1甲醇一冰醋酸固定液)。
3.向离心管中加入1ml固定液预固定。平衡后以1000rpm离心8分钟，同样剩 0.5ml上清。
4．轻轻将细胞吹成悬液，加5~6ml固定液，室温下固定30分钟。然后离心，弃上清，重复固定一次。再离心，留0.1～0.2ml上清，吹打成细胞悬液。
5．吸取1～2滴悬液，在距载片约15cm高度滴于预冷的干净载玻片上，迅速对准细胞吹气促进染色体分散。斜放载玻片，在空气中晾干(此期间配制Giemsa染液，Giemsa原液和磷酸缓冲液1:10)。
6．将标本面朝下放在染色槽中，加入染液染10分钟，自来水冲洗，晾干后观察。 (三)结果
低倍镜下，制片质量较好的标本上可看到有较多的分裂相，染色体之间分散良好，互不重叠。
油镜下观察可见每一条染色体都含有两条染色单体，两条单体由着丝粒相结。分区计数染色体数目并判定性别，或拍照后进行核型分析。 三、肿瘤细胞的染色体标本制备 (一)原理
利用肿瘤细胞无限繁殖的特点，掌握其体外生长动态，取处于对数生长期的细胞便可获得丰富的分裂相。肿瘤细胞染色体异常包括两个方面：
1．结构异常 即在肿瘤细胞常出现的染色体畸变，包括双着丝点染色体、环状染色体、断裂的染色体、染色体裂隙及微小体等。
2．数目异常 由于肿瘤细胞分裂失去应有的调控，可出现亚二倍体、超二倍体和多一 倍体数目异常现象。
肿瘤细胞染色体制备技术在细胞生物学、医学遗传学的基础研究和临床诊断、愈后观察等方面均有广泛用途。 (二)操作
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l．以1.63 10个／ml细胞浓度将FL—60细胞接种于培养瓶内，48小时后以终浓度为0.04μg／ml的秋水仙素处理2.5小时，移入10ml离心管。其余步骤与淋巴细胞染色体制备相同。
2.将长成单层的HeLa细胞按1:2传代进行培养，36小时后用终浓度为0.04μg／ml的秋水仙素处理3小时。按时终止培养，用0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液处理单层细胞，待细胞收缩变圆时，弃去消化液。加入少许低渗液将细胞从瓶壁洗脱，移入10ml离心管，加入预热37℃的低渗液至5 ~ 6ml，在37℃处理25分钟。以下步骤同淋巴细胞染色体核型制备。 (三)结果
计数HeLa细胞和HL—60细胞的染色体数并寻找是否有畸变的染色体。 附：人体染色体常规核型的分析 一、人体染色体的观察
取制备较好的染色体玻片标本，先在低倍镜下观察。在标本中选择一个染色体之间分散较
好，互不重叠的中期分裂相，置于视野中央，然后换油镜仔细观察。每个染色体都含有两条染色单体，两单体连接处为着丝粒。计数时要把分散的染色体划分为几个区域以免计数重复或遗漏，然后计数并判定性别。 二、核型分析的方法
人体染色体常规核型的分析，在今天的染色体研究水平上作为染色体结构异常的疾病诊断已经失去意义，但对染色体数目异常仍具有诊断上的价值，尤其是起着分析其它几种显带核型的桥梁作用。通过常规核型的分析必须掌握三点：(一)会分组、(二)了解各组染色体的基本形态特征、(三)会计数数目和鉴定性别。
人体染色体的常规核型即按照Denver会议(1960年)提出的染色体命名和分类标准，将人类体细胞的46条染色体按大小、着丝点的位置分成七组(A、B、C、D、E、F、G、)23对的排列。
七组染色体的基本形态特征及分析顺序是：
A组是七组染色体中最大的一组，首先找出它。A组包括三对，即第1~3号6条染色体，第1号为最大、是中央着丝点，长臂近侧有次缢痕；第2号第二大、着丝点略偏离中央；第3号为三大，是中央着丝点。
接着确定B组：B组二对即第4～5号4条染色体，较大，均为亚中着丝点，两者不易区分开。
第三确定D组和G组：D组三对即第13～15号6条染色体，中等大小均为近端着丝点，短臂末端有随体。G组二对即第21～22号4条染色体，是最小的一组，均为近端着丝点，短臂末端有随体，长臂常呈分叉状，21号稍小于22号。Y染色体被隶属于该组，短臂无随体，一般较2l、22号大点。
第四确定F组：F组二对即第19～20号4条染色体，染色体比G组稍大、均为中央着丝点。
染色体分组形态特征表
第五确定E组：E组三对即第16～18号6条染色体，较小，第16号是中央着丝点，17、18号是亚中着丝点。
余者为C组：C组七对即第6～12号14条染色体，按大小顺序依次排列，均是亚中着丝点；X染色体被隶属该组，大小居6～7号之间，是亚中着丝点。
上述人的常规核型中，1～22号为常染色体，男女共有，另一对为性染色体，决定性别，男性为XY，女性为XX，人的正常核型写法：男46，XY；女46，XX。
图15—1 各组染色体基本形态特征的模式图
【作 业】
一、计数HeLa和HL一60细胞的染色体数，它们各属哪种数目异常? 二、分析制备好的正常人外周血淋巴细胞染色体，判断其性别。
三、要想制备出好的染色体标本应该注意哪些环节?谈谈自己实验成功或失败的体会。
(王明武编)