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徐州医学院硕士论文
To verify TLR4 mRNA expression changes in the HUVEC, RT-PCR and quantitative real time PCR were performed. The TLR4 mRNA expression levels were significantly increased in the VIN-treated HUVEC (P<0.05), compared with vehicle-treated group. The effect of VIN reached a maximum at the time after exposure 1h; We performed western blot for the relative protein expression of TLR4 in HUVECs to assess the effect after treatment with VIN. The expression of TLR4 protein in all VIN-treated groups was increased significantly compared with vehicle-treated group(P<0.05); NF-κB activation as determined by NF-κB phosphorylation was detected at different time and was no longer detectable at later time points. As expected, nuclear translocation of p65 occurred in HUVEC treated with VIN, and NF-κB activation occurred within a very narrow window in HUVEC during the course of vascular endothelial injury.
Conclusions 1. Pathohistological changes of the model group were observed, such as loss of venous endothelial cells, inflammatory cell infiltration and thrombus. 2. mouse and cell experiments indicates that TLR4 expression is up-regulated in vascular endothelial injury that induced by Vinorelbine. 3. cell experiment indicates that TLR4 mRNA and protein are up-regulated by Vinorelbine in HUVEC. 4. cell experiment indicates that nuclear translocation of p65 occurred in HUVEC treated with VIN. 5. Tegether, our results suggest that TLR4 may play an important role in the development of vascular endothelial injury that induced by Vinorelbine.
Key words Toll-like receptor; Vinorelbine; Phlebitis; HUVEC; Mechanism
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前 言
随着工业化的进展、环境污染的加剧，人们的生活节奏越来越快，不良生活习惯及不良饮食的影响，肿瘤的发病率也逐年增高，无论在发达国家还是发展中国家，恶性肿瘤的危害都不容忽视。静脉输注抗肿瘤药物是治疗恶性肿瘤的主要方法之一，但往往引起严重的毒副反应，除对造血系统及全身重要脏器具有毒性以外，对血管周围组织还可引起严重的炎性刺激反应。局部组织表现红、肿、热、痛等炎症反应，有时沿静脉走向出现条索状改变，严重者局部组织糜烂、坏死。
肿瘤患者长期放、化疗，机体免疫力低下时，常导致全身感染而危及生命。
长春瑞滨是临床常见的抗肿瘤药物，属于长春花生物碱类药物，它的抗肿瘤活性主要通过干扰微管蛋白而抑制中期有丝分裂，目前主要用于非小细胞肺癌以及其他实体瘤等。然而在长春瑞滨给病人带来抗肿瘤疗效的同时，它作为中度发疱剂的一种，也常常引起局部毒副反应，局部组织发红，疼痛、肿胀甚至糜烂坏死。据报道[1]，其致静脉炎的发生率可达24-33%，国内学者报道其发生率甚至可达87%[2]。虽然这种药物性静脉炎在临床常见，但是其确切机制仍不明确，目前普遍的观点认为药物性静脉炎是由于药物对血管内皮细胞的化学性刺激而引起的无菌性炎症。
药物性静脉炎的形成因素包括药物种类、药液的温度、药液的PH值、药液的渗透压、药物本身的毒性作用、药物引起的变态反应以及药液的输液微粒等。另外药物性的静脉炎发生还与输入药液的剂量、浓度、输入速度、时间以及输注方法等有关[2-28]。抗生素和抗肿瘤药物导致的静脉炎的发生率最高[29-30]，抗肿瘤药物中以长春瑞滨最为严重。尽管临床工作者采取了许多防范措施，例如给药部位热敷、冷敷的方法，以及局部给予糖皮质激素、非甾体抗炎药、抗组胺药、血管扩张剂、局部麻醉药、抗凝药、溶栓药甚至活血化瘀类中药等，但遗憾的是由
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于缺乏相应的基础研究支持，使得这些措施针对性不强，临床效果不明显，这种由药物自身因素引起的静脉炎并未得到改善。
近年来有关静脉炎的基础研究主要是针对抗生素类药物的。目前国内外资料尚缺乏对化疗药物，特别是长春碱类化疗药物所致静脉炎的基础研究，化疗药物所致静脉炎的基础研究也仅局限于动物病理学水平，深入的机制研究鲜见报道，由此可见，深入研究药物静脉炎发病机制的需求非常迫切，在此基础上寻找临床上更为特异和有效的预防或治疗药物，对提高合理用药水平，减少药源性疾病损害，改善患者的生活质量具有重要的理论和实际意义。
国外学者研究[31-32]表明血管内皮细胞在一定浓度的高细胞毒性的抗生素的刺激下，细胞间黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、E-选择素(E-selectin)等黏附分子的表达增高，而这些细胞间相互作用相关的细胞表面标记物的表达，可能是药物性静脉炎重要的发生机制。那么临床常见的长春瑞滨所致的静脉炎中是否也存在这些细胞因子的表达变化？亦或存在其他炎症相关细胞因子的表达呢？
Toll样受体(Toll-like receptor, TLR)是一类介导天然免疫的跨膜信号传递受体家族，在细胞活化信号的转导中起重要作用，是联系天然免疫与获得性免疫的桥梁[33]。被认为是目前哺乳动物唯一将细胞外抗原识别信息向细胞内传递并引发炎症反应的关键跨膜蛋白[34]。
哺乳动物中已发现至少13种TLR和一系列TLR配体，其中人TLR为TLR1～10，它们分别在不同的免疫应答机制中扮演各自的重要角色。免疫细胞通过其表面的Toll样受体家族(Toll-like receptors, TLRs)识别病原微生物启动天然免疫反应。各种不同的病原体，包括革兰阳性菌、革兰阴性菌、真菌、病毒和衣原体均可以被TLRs识别。在天然免疫过程中，TLRs捕获病原体上相应配体，启动细胞内信号途径，导致一系列酶的激活、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）途径活化及炎症因子的释放。
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TLR4在该受体家族中最早被发现，定位于人染色体9q32-q33上，组织分布较广泛，见于血管内皮细胞、单核细胞、中性粒细胞、树突细胞、小肠上皮细胞、呼吸道上皮细胞、人齿龈成纤维细胞、人子宫颈平滑肌细胞、大鼠脾和心肌细胞等，主要功能是作为脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)的信号转导受体，在宿主的防御反应中发挥重要作用[35-36]。
TLR4主要识别革兰阴性菌成份LPS，LPS通过激活宿主细胞膜上的CD14和TLR4受体，进一步活化NF-кB，使单核和巨噬细胞产生IL-21、6、8和肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)，趋化炎性细胞浸润，诱发炎症，刺激树突状细胞成熟，启动先天和后天免疫。研究表明，TLR4不仅通过识别革兰氏阴性菌的LPS 启动细胞内信号转导，同时也识别结核分枝杆菌、烟曲菌、新型隐球菌和白色念珠菌等其他微生物的病原相关分子模式[37]。大量研究已证实TLR4在败血症、脓毒症、肠炎、阑尾炎、胰腺炎等感染性炎症反应中都发挥了重要作用。
越来越多的证据显示，即使没有感染存在，内源性配体也可以刺激TLR4并引发免疫反应[38]。为区别微生物来源的外源性分子(如LPS等)，将其命名为TLRs的内源性配体。目前发现TLR4可以识别多种内源性配体，如透明质酸、硫酸肝素、纤维蛋白素原、高迁移率族蛋白1和热休克蛋白等。研究发现除了外源性配体以外, 内源性分子，比如热休克蛋白60(HSP60)、纤维结合素、纤维蛋白原和透明质烷低聚糖也能够通过TLR4诱导促炎细胞因子的产生[39]。另一项研究也表明，某些创伤和手术等引起的全身炎症反应综合症和远离组织器官损伤时，循环中并未检测到细菌和内毒素，而应用TLR4阻断剂可明显减轻炎症反应和组织损伤，因此可能不是内毒素，而是内源性配体激活了TLR4[40]。机体受到刺激时，体内某些内源性分子能从激活的免疫细胞、肠上皮细胞主动分泌或者从坏死或损伤的细胞中被动释放出来。这些内源性分子可被TLR4识别并结合，进一步诱导单核-巨噬细胞系统及树突状细胞的活化和成熟，促进炎症因子的释放[41]。以上研究均表明TLR4在非感染
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