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徐州医学院硕士论文
性免疫炎症反应中也发挥了重要作用。
虽然迄今尚无TLR4参与药物性静脉炎形成的相关报道，目前也尚不知道TLR4是否参加了VIN引发组织损伤的信号转导。但是基于药物性静脉炎的本质是由于药物对血管内皮细胞的刺激而引起的一种化学性炎症反应，而TLR4不仅可启动机体抗感染性免疫炎症反应，它还在非感染性免疫炎症反应的介导和信号转导中发挥重要作用[42-46]。我们提出如下设想：TLR4在长春瑞滨致静脉炎过程中发挥着重要作用。长春瑞滨致静脉炎的可能机制是：长春瑞滨刺激血管内皮细胞膜上的TLR4受体后，导致NF-κB信号转导途经被激活，内皮细胞被活化；活化的内皮细胞与其配体结合，从而与白细胞黏附，导致内皮损伤和白细胞渗出，激发炎症过程，并继而通过一系列反应激活血小板聚集与血栓形成过程。
为验证上述假设，本研究拟选择临床反应强烈、具有一定代表性的长春碱类药物长春瑞滨为研究对象，通过体内体外实验观察VIN对小鼠尾静脉血管内皮细胞以及人脐静脉内皮细胞(Human umbilical venous endothelial cells，HUVEC) TLR4表达及下游NF-κB活化的影响，初步探讨TLR4在VIN损伤血管中的作用。
本课题采用动物组织病理学及细胞形态学明确长春瑞滨对血管内皮细胞的损伤作用；分别采用动物和细胞的免疫组织化学、荧光定量PCR 、Western-blot分析明确TLR4基因及蛋白表达受长春瑞滨刺激的变化规律；采用免疫荧光染色法考察考察长春瑞滨致静脉炎的过程对NF-κB活化的影响。本研究不仅有助于认识TLR4与长春瑞滨致静脉炎发生的相关性，也有助于深入了解药物性静脉炎的发生机制，而对于这一机制的认识，将会为该类静脉炎的防治提供新的基础理论依据，可能为今后临床治疗静脉炎提供新的途径与思路。
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第一部分
Toll样受体4在长春瑞滨致小鼠静脉炎组织的表达及意义
材料和方法
1 材料
1.1 主要试剂
长春瑞滨
兔抗小鼠TLR4多克隆抗体 辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗 DAB显色试剂盒 多聚甲醛 1.2 主要仪器
倒置显微镜（IX71） 病理组织包埋机 病理组织漂烘仪 电子pH计
电子天平（Mettler AT261） 石蜡切片机（RM2235） 微量移液器 1.3 实验动物
Sigma公司 Bioworld公司
北京中杉金桥生物技术有限公司 北京中杉金桥生物技术有限公司
国药化学试剂有限公司
OLYMPUS公司
常州市中威电子仪器有限公司 常州市中威电子仪器有限公司
瑞士Mettler公司 瑞士Mettler公司
Leica公司
京君龙实验仪器有限公司
雄性清洁级BALB/c小鼠，7～8周龄，体重为24～29g，购自扬州大学，动物许
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可证号：SCXK(苏) 2007-0001，饲养于徐州医学院实验动物中心。 1.4 主要试剂的配制
1.4.1 PBS（0.01mol/L）缓冲液：
NaCl KCl NaH2PO4 K2HPO4 8.00g 0.20g 1.44g 0.24g 800ml双蒸水溶解，1mol/L盐酸调节溶液的pH至7.4，双蒸水定容至1L，高压灭菌后室温保存（注意：高压灭菌后用灭菌双蒸水补充定容）。 1.4.2 4%多聚甲醛溶液：
称取40g多聚甲醛，加至800ml 双蒸水中，滴加适量0.1M NaOH溶液促进多聚甲醛溶解，搅拌混匀，待多聚甲醛完全溶解后，加100ml PBS（0.1mol/L），双蒸水定容至1L，浓盐酸调pH至7.30~7.40，0.45μm滤膜过滤，4℃保存备用。
1.4.3 0.5 mol/L EDTA：
量取90 mL双蒸水，加入20gEDTA，用NaOH调节PH至8.0，磁力搅拌溶解，用1 mol/L HCL调节PH至7.3-7.5，定容至100 mL，过滤除菌，室温保存。 1.4.4 清洁液配制
重铬酸钾 浓硫酸 蒸馏水 120g 200ml 1000 ml 应于陶瓷容器中配制，配制时先将重铬酸钾完全溶解于蒸馏水中，然后缓慢加入浓硫酸，边加边用玻璃棒搅拌以助散热。 2 方法
2.1 实验分组及干预
参考黄吉春[26]等的造模方法实施预实验，结果显示3.2 g/L长春瑞滨注射后
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48 h取材时小鼠静脉炎发生率为100%，无小鼠死亡，所以本次实验选择此药物质量浓度与取材时间点。取20只BALB/c小鼠，按随机数字表随机分为2组，每组10只。实验组按38 mg/kg尾静脉注射3.2 g/L长春瑞滨；对照组尾静脉注射相同体积的生理盐水。具体给药方法为选用小鼠一侧尾静脉注射药物，常规消毒，微量注射器接4号针头抽取少量生理盐水，于小鼠一侧尾静脉中、远1/3处向近心端穿刺。针头进入血管后，先注射生理盐水约50 μL，确保针头在静脉内药物无外渗后，换为长春瑞滨注射，2 min内注完，随后用少量生理盐水冲洗。注射完成后检查血管，疑有药物外渗者立刻废弃并重新补充小鼠入组，注射完成后予无菌棉球按压止血。 2.2 观察及检测指标
2.2.1 一般状况及静脉炎临床分级
注射药物48 h后观察小鼠活动、精神状况以及鼠尾外观表现。同时按照美国静脉输液护理学会制定的标准，结合动物实验特点，去除评价标准中有关疼痛的指标，将静脉炎分为5个等级，见下表。
小鼠静脉炎分级标准
分级
0 无症状 1 局部红斑 2 局部红斑或红肿
3 局部红斑并且红肿或可见静脉血管内条索状淤血
4 局部红斑和红肿并且有可见静脉血管内条索状淤血，或膨突 5 局部化脓并且伴有4所有症状或溃烂 2.2.2 组织病理学检测及评分
组织石蜡切片制作：①于给药后48 h颈椎脱臼处死小鼠，并取近心端距穿刺点1 cm处鼠尾组织，40 g/L多聚甲醛中固定24h后以0.5 mol/L EDTA进行脱钙1周。
炎症标准
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