发布时间 : 星期一 文章生物质谱在蛋白质组学研究中应用 - 图文更新完毕开始阅读90b8be19a300a6c30c229fd3
关键问题（1）第一步标记反应的完全性，即期望只得到+4Da的标记产物；
（2）标记完后胰蛋白酶的彻底灭活，避免回交发生； （3）质谱峰面积和强度定量。
影响因素考察
（1）反应时间的考察
在pH=4-5的KH2PO4缓冲体系中，37℃,标记反应持续：19h-24h （2）、标记稳定性（胰酶灭活）条件的优化
微波初灭活；TCEP还原胰蛋白酶的二硫键并用碘乙酰胺封闭及和盐酸胍胍基化灭活。
标记肽段于-20℃放置一个月后，仍非常稳定。没有回交现象出现。说明优化之后的18O标
记技术可以有效抑制18O-16O回标现象。
一个月后1:1标记磷酸化肽段质谱图 （3）标记方法的动态范围及灵敏度
四个磷酸化肽段25倍动态范围时，标记的线性相关系数R2均可达0.99以上，标记误差在23%以内（样本量是1:1时标记误差最小），呈良好的线性关系。
将四
个肽段的标记比值取平均值后，标记的线性相关系数R2更高，结果更接近真实值，所以采用多肽段对蛋白质进行定量的策略可保证更高可信度和准确度. 该方法在LTQ-FT质谱仪中的灵敏度为：50 fmol
（4）18O标记磷酸化肽段在IPG-IEF与SCX分离富集路线中稳定性的考察