发布时间 : 星期六 文章荧光定量PCR问题疑难解答更新完毕开始阅读93b057dca58da0116c1749a3
倍以上（一定不要用TE稀释，要不然可能会更差），问题基本解决；
3、如果模板稀释后基线还有一定的上升，结果分析时可以将基线从6以上设，避开初始的几个上升厉害的循环；
建议：要根本解决此问题请用质量可靠的试剂，便宜没好货！
Q：分子信标做的阴性对照，曲线为一条斜线，什么原因？
A：和我以前做得没消除背景的曲线挺相像。很可能是试剂的问题，我用东洋纺的试剂也得到过类似的曲线，换了试剂就好了！探针设计的问题！还有反应液体试剂酶离子调整。
Q：标准曲线检测限
A：这是由于ABI仪器采用半导体加热，其边缘效应致使96孔加热模块的中央温度高，周边温度低。由于定量原理是通过已知浓度的标准品和未知样本之间的比较来进行的，所以各孔位的反应参数可比性决定了定量的准确性。在模板浓度低的时候ABI的仪器各孔位热循环不均导致的误差经过多个循环后被放大，最终影响定量结果的准确性。所以ABI仪器只能区分5000个拷贝和10000个拷贝的差异，而且必须用ABI的原装试剂才能达到此效果，如果将模板再稀释，就无法区分这2倍浓度差异了。
你加入起始模板数分别是1000、100、10copy/ul 的反应孔，模板浓度太低了，ABI7000仪器不能检测出来，建议用高浓度模板来做标准曲线。
虽然现在的定量PCR仪好多都宣称能做到单拷贝检测，但这个前提是非常苛刻的。需要模板、引物、体系、实验条件设置一切都是最优的情况下才可能做出来，而且一般还有比例。像一般低拷贝检测Ct值不准确的情况还是很正常的，不需要郁闷的说，大家都是这样。一般临床检测的下限不会低于100拷贝，所以你要考虑是不是真的要做低拷贝的检测，另外，当Ct值大于30的时候结果就存在很大的不可信性，要反复确认，而低拷贝的Ct值一般都会大于30。
Q：溶解曲线3个峰
A：如果出现引物二聚体，可以从实验条件和体系上加以优化，比如提高退火温度，降低引物浓度等。但如果非特异性的峰离目标产物的峰较近的话，那就需要重新设计引物了，从引物的设计上多做些考虑。可以先优化条件，如果没有用的话就试试改变引物。
引物二聚体的几个特征是溶解曲线的峰不明显，即峰不尖且不高，另外是溶解温度基本上低于80度。如果不符合上面的两个条件，基本上就是体系污染了。可以跑个电泳看看。
样本出现双峰，也可以按照上面的判断看看是否有引物二聚体还是非特异性扩增产物。
可以提高2度退火温度试试看，延长退火时间对于消除引物二聚体的作用不大。
基本上采用染料法的确容易出现引物二聚体，尤其是30个循环之后。如果提高退火温度后空白对照还是起峰，但Ct值在35之后，那就不要管他了，正常。
Q： A：你的实验结果其实很好，是初始模板浓度设置错了。
1. 以2倍梯度稀释的模板，Ct值的差异为1的时候扩增效率为100%，从标准曲线上来看，你的6个模板Ct差异（标准曲线横轴）还都在1以上一点，已经很好；
2. 你的模板是以2倍梯度稀释的，这样初始模板拷贝数的对数值每个浓度相差应该在0.3左右，从图中看，标准曲线的纵轴每个梯度相差在0.7左右，似乎你设置时初始模板的拷贝数是 按照5倍梯度设置的。你可以把Ct值取出来，根据初始模板自己做一个标准曲线看看，估计扩增效率可以达到90%以上。2倍梯度区分的很好！
Q：只要Ct值大于30都是阴性吗？一开始不用设定吗？
A：看你做什么检测了，还要与对照品比对才能定性分析。不过，一般Ct值大于30结果置信度降低，需要多次确认。
常规修饰基团分子量
5’-Biotin 405.45 3’-TAMARA 623.60 5’-(6 FAM) 537.46 3’-Dabsyl 498.49 5’-HEX 744.13 3’-(6 FAM) 569.46 5’-TET 675.24 3’-Amino Modifier C3 153.07 5’-Cy5 533.63 3’-Amino Modifier C7 209.18 5’-Cy3 507.59 3’-Thiol Modifier C3 154.12
Q：溶解曲线出现三个峰，以为是引物合成问题，重新合成三次引物，溶解曲线仍为三个峰。产物经电泳证实却为一条带，为什么会出现这种结果？
A：我也曾经出现过这个问题，但是我是出现两个峰，后来跑电泳证实是引物二聚体，<100bp的地方隐约出现一个引物二聚体的条带，你跑电泳没有其他条带可能是电泳的灵敏度不够吧，还有引物产生二聚体也不一定只产生一种结构的二聚体啊，可能会产生其他结构的二聚体啊，建议你可以继续设计引物再试试，或者提高退火温度看看！
你的单一条带是不是很宽啊？照图上看来你的非特异性的产物和你的目的产物差不多大。非特异性扩增的条带的Tm值和你的产物的还是有点接近。而且不一定是跑胶都能看到非特异性扩增的。我以前做完后跑胶都没有目的条带，但是扩增曲线还是不错，但是荧光值都比较低。实时定量还是很敏感的。
建议提高温度，如果没有目的条带，就试着调一下镁离子浓度。
Q：最近作Real-time PCR有几个问题请教： 1. 产物可以进行电泳检测吗？
2. 为什么阴性产物进行二次扩增也有较强的荧光信号（据Ct值可判为阳性）？且电泳似乎也有较亮的条带，无法与阳性产物区别。 3.在Ct值无法判断阴性或阳性的情况下（接近或略高于判定阴性值时，有扩增曲线，但Ct值较大如37、38）如何下结论？
A：1. 荧光定量的结果可以进行电泳检测。
2. 如果阴性有扩增，说明PCR体系被污染了，PCR污染是很可怕的，而且很难消除。
3. 结论根据原来定的标准下，比如原来设定ct>35为阴性，那当ct为36时就不要特意调整标准。确定其为阴性就可以了。
4. 阳性产物做模板ct较低，其原因是模板浓度较高，模板浓度的对数和ct成反比。所以，模板浓度越高，ct越低。
A：1. 产物是可以用来电泳的，不过由于定量PCR借助于荧光的作用灵敏度较高，电泳产物则一般条带不会很亮；
2. 产物的二次扩增在定量PCR中一般是不建议做的，原因很简单，片段太短了，还是那个问题，定量PCR是高灵敏度的，再二次扩增很难排除二聚体、PCR污染、操作误差等等因素，特别是污染，我们能排除的往往都只是你想到的，还有很多是一时想不到的； 3. 如果你是用标准的检测试剂盒，你只需要按说明书来就操作就可以，判断结果同样，如果你还想探究其中的阴性可能漏检的问题，你应该用其他方法，而不能用这个试剂盒了。
Q：通过前辈的介绍了解到：正常的ct值范围在18~30之间，ct值应是荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。如果正常情况下大于30应可以定为阴性。因为最近我也在用SYBR Green做实时定量PCR，所以也想向各位前辈请教一下有关Ct值的问题。我的结果中待测基因的Ct值大多在18~25之间，但唯独内参照的Ct值很低。第一次做时基本都在10左右，将模板稀释10倍后第二次的内参照的Ct值还是在12~14之间。以这样的数据分析会影响结果的准确度吗？或者还是将模板继续稀释，直到ct值都达到18~30之间呢。
A：没必要吧。一般ct超过30是不好，但要是三个重复都这样，也还是可以用的啊，每次都做阴性对照阴性对照ct为0，那ct30就肯定不是污染，而是基因表达量低或是模板太稀，内参ct为10~14都正常啊，没必要再稀释模板了，那样你的目的基因ct又要超过30了，不过内参ct太低，低于10也是不太好，结果可能会有偏差。
Q：real-time pcr结果可用来发文章的要求有哪些？
A：不用，但是在文章必须说明用电泳还是用溶解曲线检测过。论文中把你的实验方法说明白就可以了。简单的一个表示图，就可以发表了。不过REAL-TIME PCR 想用的话最好放溶解曲线图，一般外文杂志喜欢接受。
Q：不知道为什么这两天做荧光老不顺，荧光Ct在20以下产物检测很亮，而普通用mix酶跑PCR条带却很淡，难道是荧光定量的酶比较好的原因吗？另外我的NTC荧光在30
多个循环的时候都有起峰，我用重开的一管新酶和新稀释的引物以及新水做，还是有起峰，实在是搞不懂了。求大家帮帮忙吧！
A：1. 一些公司荧光定量试剂盒的酶是比普通Tag酶要好，主要是可以防止引物二聚体产生，引物二聚体少了，扩增效率自然高了。
2. 也可能是你荧光定量的体系比你普通的PCR体系要优化，比如有些公司荧光定量mix中的Mg离子浓度要高于普通的PCR体系。
3. 可能是跑胶的问题。看看你的MARKER还和以前一样亮吗？
做荧光定量的短片段特别容易污染。可能是你的枪被污染了吧，是用的跑电泳的那把枪吗？如果在35个循环后起峰，污染不算严重。可以把荧光定量PCR的基线调节到恰好高过阴性对照。
Q：请问下现在的PCR荧光诊断试剂盒里面，国家规定都要求要有临界阳对照吗？这些对照品是不是一定要和样本一起提取呢？还有临界阳用阳性对照来稀释来得到可以吗？不知道要怎么稀释比较好呢？
A：阳性对照和阴性对照必须要和样品一起提取，进行平行实验，这样才有作为对照的意义。临界阳性样品是不能通过阳性对照稀释的，除非你知道临界阳性的浓度，经过定量标定将阳性对照稀释到临界阳性。
Q：本人检测的目的基因共有5个处理，每个处理做两次重复，现在的问题每个处理内重复性非常差，有的Ct值差异达到了10，不知道是怎么回事？
A：换了一个退火温度把所有的设计好的引物都拿来重新试了一下，现在有一对引物两个温度都还好。基本上能够达到要求了。另外，我使用的是BIO-RAD的仪器，感觉边上跟中间温度差异挺大的，因为之前这对引物我也曾经试过的，但是放在边上一个，结果差异很大。经验教训啊！
Q：荧光量开始很高 A：根据TAKARA的资料说，这是因为摸板浓度过大了，把它再稀释，然后再做看看。是模板浓度过大引起的，可以看到曲线图中最高浓度的样品的Ct值很小。但是这张图也能用的，你调整一下基线范围，把背景荧光压下去，这样以来图就漂亮了就能分析了。 Q：刚做了一次real time PCR，结果解离曲线中出现了负值
A：这个曲线反应的是随着温度的变化荧光值的变化速率。值越高，则此时PCR产物荧光值变化越快，也就是说PCR产物变性速度最快。当温度达到Tm值时，PCR产物迅速变性，荧光值急剧下降，表现在这张图上就是出现一个峰。产物越纯，峰越窄，PCR产物越多，峰越高。这样看来，出现负值表明此温度下PCR产物变性速度没有两边的温度是快。70-80度时，已经出现变性，但是较为缓慢。但是你的产物看来不是特别纯，峰比较宽，可能要改变反映条件或者改变引物。