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而采用常规有性杂交则需十几年,甚至20年.
7.4.5其他 花药培养亦可用于品种提纯复壮.而远缘杂交种的花药与花粉培养,可克服其不孕性.此外,花药与花粉培养作为一项实验手段也被用于花粉发育及其控制,物种形成等理论研究.
复习思考题
(1)花药培养和花粉培养有何区别
(2)花药培养时选择什么发育时期的花药 为什么 (3)花药培养时培养基配制有什么特点
(4)花粉培养时怎样使用微室培养和看护培养. 第八章 园林植物胚胎培养(2学时) 教学目的与要求:
1,通过本课学习使同学们了解园林植物胚乳和胚珠,子房培养; 2,掌握园林植物胚培养. 教学重点与难点:
重点:园林植物胚培养. 难点:幼胚培养时期的选取.
胚胎培养是将植物的胚胎与母体分离,培养在已知化学成分的培养基上.目前,这项技术主要应用于解决育种实践中遇到的问题,也广泛地被用来研究胚胎发育过程中与胚发育有关的内外因素,以及与其发育有关的代谢和生理生化变化.这里叙述的胚胎培养,包括幼胚培养,成熟胚培养,胚乳培养,胚珠培养以及子房培养. 8.1胚培养 8.1.1培养类型
一般情况下,植物的胚胎是从精卵结合形成合子开始的.合子经过分裂形成胚柄和胚体,胚体进一步分裂,并且分化,逐渐形成具有一定形态结构的胚.当种子萌发时,胚长成植株.所谓胚培养就是指采用人工方法把胚从种子,子房或胚珠中分离出来,再放在无菌条件下,让其进一步生长发育,以至形成幼苗的过程.胚培养的对象包括胚胎发生过程中不同发育时期的胚和具胚器官.胚的发育对营养的要求有两个阶段.分别是:①异养期,处于这一时期的幼小胚完全依赖和吸收周围组织的有机营养物质;②自养期,在此时期胚能吸收培养基中的无机盐和糖,经过自身的代谢作用合成其生长所必需的物质.根据这一特点,将离体胚的培养分为两种类型:即成熟胚培养和幼胚(指子叶形成之前)培养. 8.1.2 培养过程
8.1.2.1 幼胚培养过程
(1)摘下大田或温室里种植的杂交植株的子房.
(2)用70%乙醇进行几秒的表面消毒,接着用饱和漂白粉或0.1%升汞浸泡10—30min.再用无菌水冲洗3～4次,去除残留的药物.
(3)无菌条件下,在高倍解剖镜下进行解剖.用刀片沿子房纵轴切开子房壁,再用镊子夹出胚珠,剥去珠被,取出完整的幼胚,接种在配好的培养基上培养.
(4)幼胚培养一般采用固体培养方法.将幼胚接种在培养基上后,放在培养室中培养. (5)培养室温度20—30℃,光照度2000lx,每天光照10～14h. (6)培养一段时间后,观察幼胚的发育.
(7)幼胚培养时,其发育过程有下列三种方式.
①胚性发育.在幼胚培养中,促成胚的正常生长是我们的目标,但在培养中往往出现胚性生长,即胚只是在体积上增大甚至超过正常胚大小而不能萌发成苗.
②早熟萌发.指在幼胚培养中,胚迅速萌发成幼苗的现象,这时长成的苗十分瘦弱.
③产生愈伤组织.指在幼胚培养中常能诱发胚细胞增殖而形成愈伤组织,再由愈伤组织分化形成胚或不定芽.
8.1.2.2 成熟胚培养过程 下面以玉米成熟胚培养为例介绍其培养过程.
(1)取30粒玉米种子,放在盛有95%的乙醇中消毒l0s,再用蒸馏水冲洗.检查果皮是否完整,若有水进入果皮内而呈透明斑块的种粒,应丢弃.保留那些果皮完整,外貌无改变的种子.在无菌条件下,将种子放入75%乙醇中消毒15s,用无菌水冲洗3次,用10%(W/V)次氯酸钠溶液浸泡20min,再用无菌水冲洗3次.
(2)在直径90mm的培养皿中放置1张湿润的无菌滤纸.在每张滤纸上接3粒种子.于25℃的黑暗条件下培育6h,种子将吸水膨胀,变软.
(3)种子吸涨后,将种胚剥离出来.取1粒种子放在无菌培养皿中,用镊子夹住,用另一把镊子轻轻剥去种皮(两者愈合在一起).解剖刀沿着胚胎的边缘小心切除胚乳,暴露出位于其下方的种胚的一部分——盾片.分离出胚胎后,用无菌水将每一个胚胎冲洗3次,然后移人装有培养基的三角瓶.培养基为MS培养基. (4)25℃的黑暗环境中培养.
(5)培养结果:大约在培养2d后出现胚根,3-4d后出现胚芽,7～9d后初生根迅速生长并出现一些不定根,l0d后可以长成小苗. 8.1.3 培养基与培养条件 8.1.3.1 培养基
根据不同的研究目的和应用要求,取出不同发育时期的胚作离体培养,可分为成熟胚和幼胚培养.成熟胚是一个充分发育的两极结构,即含有根原基和茎原基以及一个或两个次生附属子叶.在培养时,成熟胚进一步发育,产生根和茎.这时期的胚在营养上是相对独立的,只需要提供简单的营养条件,在含有大量元素的无机盐和糖的培养基上即能生长.而未成熟的幼胚,当它在胚囊里生长时,不仅依赖于周围细胞中的代谢,而且依赖于周围胚乳消耗的养料.与成熟胚的相对自养性比较,幼胚则完全是异养的,在离体情况下,要求更复杂的培养基.除了一般的无机盐成分外,还要加入微量元素和各种生长辅助物质.培养不同发育时期的幼胚对培养基成分的要求不同,胚龄越小,要求的培养基成分就越复杂.
用于培养成熟胚的培养基主要是Tukey,Randolph,White培养基.在培养基中以大量元素和微量元素的无机盐为基本成分,此外还加入一定浓度的糖类物质和多种生长辅助物质. 用于培养幼胚的培养基主要有Cox,Rijven,White,Rangaswang,Norstog等幼胚培养基以及植物组织培养常用的MS,B5和Nitsch培养基.幼胚培养基中添加的蔗糖,维生素和氨基酸在胚培养中起着较为重要的作用. 8.1.3.2培养条件
8.1.3.2.1糖类 糖类在培养基中主要作为有机碳源起营养的作用,并调节培养基的渗透压.糖类对于幼胚及脱离胚乳或与子叶分离后的成熟胚培养都是必需的.因为它们本身缺少贮藏物质,且不能进行光合作用.培养基中加入的糖类以蔗糖最为适宜,有时也可用葡萄糖或果糖.不同发育时期的胚要求的渗透压不同,对培养基中蔗糖浓度的要求也不同.处于发育早期的幼胚需要较高的蔗糖浓度,如果浓度过低,即引起胚胎过早萌发,高的蔗糖浓度可以抑制离体胚的早期萌发.随着胚的发育,则要求逐步降低蔗糖浓度. 8.1.3.2.2生长辅助物质
(1)维生素类 如盐酸硫胺素(VBl),盐酸吡哆醇(VB6),烟酸(VB3),肌醇,泛酸钙(VB5),抗坏血酸(VC)等.维生素对培养发育初期的幼胚来说,一般认为是必须的.但是维生素在各种培养基的用量及组成上不是一成不变的,因为细胞能通过生物合成提供满足于自身需要的维生素.维生素及其衍生物对胚生长的促进作用不同,例如盐酸硫胺素对几种植物胚的培养表现出促进根的伸长,而生物素,泛酸钙和烟酸对茎生长的促进作用比对根更为显著.