发布时间 : 星期二 文章《分子生物学》实验报告-植物基因组DNA的提取及其定性定量分析更新完毕开始阅读9d35bfedb94ae45c3b3567ec102de2bd9605def5
实验二 PCR扩增目的片段
【实验目的】
通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。 【实验原理】
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种体外核酸扩增系统，其原理类似DNA分子的天然复制过程，是将待扩增的DNA片段与其两侧互补的两个寡聚核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。
典型的PCR 反应体系由如下组分组成：DNA 模板、反应缓冲液、dNTP、两个合成的
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DNA引物、耐热DNA聚合酶。PCR的工作程序实际上是一个在模板DNA、一对已知序列的寡核苷酸引物和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应。整个扩增过程分三步：① 变性，加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段；② 退火，快速降低温度至50-60℃ 后，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，即退火阶段；③ 延伸，溶液反应温度升至72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4 种脱氧核苷三磷酸（dNTP)，按5′→3′方向复制出互补DNA ，即引物的延伸阶段。完成以上三步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA量就增加一倍，新形成的DNA链又成为下一轮循环的模板。经过25-30个循环后，DNA可扩增106-109倍。PCR扩增的特异性取决于引物与模板DNA的结合。
【仪器、材料与试剂】 一、仪器及耗材
PCR热循环仪、台式离心机、电泳仪、凝胶成像系统、移液器（0.1-2.5 μL）、200 μL PCR管、吸头、离心管、手套、制冰机、微量移液器（10、100、1000 μL量程各一支）、100 mL或250 mL锥形瓶、量筒、点样板或parafilm、吸头、PE手套和乳胶手套。 二、试剂
1. 10 × 缓冲液
2. DNA 模板 1 ng/μL（以实验一 提取的拟南芥基因组DNA为模板） 3. dNTP Mix (Takara) 4．引物
P3： 5′-CGG GTA CCG GTG AAT TAA GAG GAG AGA GGA GG-3′ P5： 5′-ACT CTA GAT GAG TAA AAC AGA GGA GGG TCT CAC-3′ 引物溶液浓度：2 μM 5. rTaq 酶 5 U/μL 6. 低熔点琼脂糖
7. 去离子水或TE（pH7.6）
【实验步骤】
1．在200 μL PCR 管内配制20 μL 反应体系：
反应物 体积/μL
【7】
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ddH2O 11.3 10×PCR 缓冲液 2.0
dNTP 1.6（终浓度20—200 μM） 引物1 2.0（引物终浓度0.2 μM） 引物2 2.0（引物终浓度0.2 μM） 模板DNA 1.0 rTag 酶 0.1 Total 20 视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
2. 将上述试剂依次加入PCR薄壁管。加样后用手轻弹混匀，6,000 rpm离心15 sec使反 应成分集于管底。
3. PCR反应热循环程序设置：
① 94 ℃ 预变性 3 min; ② 94 ℃ 变性 30 sec;
③ 64 ℃ 退火 30 sec; 30 cycles ④ 72 ℃ 延伸 1 min; ⑤ 72 ℃ 延伸 10min; ⑥ 16℃ pause
反应结束后短暂离心，置4℃ 保存备用。 4. 配制1％的琼脂糖凝胶。
5. 取5 μL PCR产物，加1 μL的6× loading buffer(上样缓冲液)，轻弹混匀后进行电泳检测。 6. 如果PCR产物非常特异，可以直接用于与载体的重组连接。 【实验结果】
本实验扩增片段长652 bp。 注意事项：1、加样时要精确用移液器。
2、检查PCR仪是否热盖。
3、每种试剂弹化后要离心；
做MIX时，最后加酶，分装之前要混匀； 分装后需离心混匀。
实验二的PCR扩增
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实验结果与分析
用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，电泳结果如图所示，有DNA条带，约600 bp；或者无DNA条带。
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