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第九章微生物基因表达的调控
1.简述负控诱导和正控诱导两种操纵子转录调控的差异。
二者的主要差别在于：(1)调节基因的产物在负控诱导中是阻遏蛋白；在正控诱导中是激活蛋白。(2)阻遏蛋白的结合位点是操纵区；激活蛋白的结合位点是激活蛋白结合位点。
2.为什么说乳糖操纵子的功能实际上是在正、负两个相互独立的调控体系作用下实现的?
虽然乳糖操纵子是典型的负控诱导系统，在环境中如果有乳糖或类似物，就可诱导转录，但是如果没有CAP-cAMP正调控因子与操纵子相应部位的结合，乳糖操纵子即使在有诱导物的存在下，也不能转录，所以它是受双重控制的。
3.在负控系统中，如果操纵区缺失，将会发生什么情况?在正控系统中又将怎样呢? 在负控诱导系统中，如果操纵区缺失，将发生组成型的合成利用乳糖的酶。在负控阻遏系统中，则实际上是形成了抗阻遏突变，无论阻遏物是否存在，细胞均能不断合成终产物(如色氨酸)。在正控诱导系统中，激活蛋白的作用部位不是操纵区，故不受影响。
4.5.ppGpp在转录和翻译调控中起什么作用？（细菌的应急反应与ppGpp关系） 答：当细菌处于一种氨基酸全面匮乏时，细菌会采取一种应急反应以求生存，即停止包括各种RNA（特别是rRNA）在内的几乎全部生物化学反应过程，只保持维持生命最低限量的需要。实施这一应急反应的信号，是鸟苷四磷酸（ppGpp）和鸟苷五磷酸（pppGpp），产生这二种物质的诱导物是空载tRNA。氨基酸缺乏时，出现空载tRNA，这种空载tRNA会激活焦磷酸转移酶，使ppGpp大量合成，其浓度可增加10倍以上。PPGpp的出现会关闭许多基因，当然也会打开一些合成氨基酸的基因，以应付这种紧急情况。关于ppGpp和pppGpp的作用原理，目前认为有二种可能：①ppGpp与RNA聚合酶结合，使后者构型发生改变，从而识别不同内启动子，改变基因转录的效率，或关闭、或减弱、或增加；②ppGpp与启动子结合，使后者不再与RNA聚合酶结合，导致基因被关闭。实际上这二种作用都将是导致某些重要的启动子的关闭或开启某些弱启动子。
5.为什么弱化作用只影响合成代谢途径?而阻遏作用既影响合成代谢途径也能影响分解代谢途径?
因为弱化作用是受氨酰-tRNA的控制，是氨基酸合成代谢途径中的一种调控作用；而阻遏作用中，操纵子是受阻遏蛋白的控制，是调节基因的产物，在分解代谢(乳糖的分解)和合成代谢(色氨酸的合成)中均存在。
6.原核生物只有一种RNA聚合酶，通过什么途径识别不同的启动子并进行不同基因的转录?举例说明。
原核生物的RNA聚合酶通过与不同的σ因子结合组成全酶后才进行工作。不同的σ因子协助RNA聚合酶识别不同的启动子，并启动转录。例如：大肠杆菌在正常的条件
下，σ70因子指导RNA聚合酶的活化；如果大肠杆菌生长在较高的温度下，便产生σ32，由σ32参入构成的RNA聚合酶全酶能够识别热激应答基因的启动子，刺激产生大量的热休克蛋白质，保证细胞不受高温的伤害。此外，枯草芽孢杆菌中通过利用大量不同的σ因子识别不同的启动子从而控制芽孢的形成过程也是研究得比较详细的例子。
1.解释为什么无义密码子在蛋白质的合成中为终止位点，而在mRNA的合成中就不能作为终止位点?
这里涉及两个基本概念：转录和翻译。蛋白质的合成(即翻译)是以mRNA为模板，通过氨酰-tRNA将其遗传密码翻译成为多肽的复杂过程。当核糖体到达3种无义密码子(UAA、UAG和UGA)中的任何一个时，由于没有任何氨酰-tRNA与这些终子密码结合，所以不能将这些密码翻译成氨基酸，肽链的合成便被终止。在mRNA的合成(转录)中，是以DNA为模板，通过RNA聚合酶催化合成RNA的过程。即以一条DNA链为模板，按照碱基互补的原则进行转录，不涉及终止密码。转录的终止是通过终止子(terminator)而实现的。
第十章微生物与基因工程
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8.克隆载体对宿主的基本要求是什么? 克隆载体对宿主的基本要求是：①能够高效吸收外源DNA；②不具有限制修饰系统；③不具有DNA重组系统；④根据载体类型和标记选择相应宿主；⑤具有安全性。宿主细胞应该对人、畜、农作物无害或无致病性等。
9.何谓抗生素抗性基因插入失活法?何谓β-半乳糖苷酶显色反应法?在筛选阳性克隆时，后者为何比前者更为简单有效?
抗生素抗性基因插入失活法是指将外源DNA插入到载体中任何一个抗生素抗性基因编码序列内，导致抗生素抗性基因“插入失活”。如在质粒中含有四环素抗性基因，四环素抗性基因内含BamHⅠ位点，若将外源DNA插入此位点，然后转化大肠杆菌(tets)并培养在含四环素的平板上。那些含有外源DNA的转化细胞失去对四环素的抗性，所以不能在四环素平板上生长。而不含外源DNA的转化细胞，则可在四环素的平板上生长。这样通过四环素平板和非四环素平板得影印平板对照，就可以在非四环素平板上筛选到含有目的基因的细菌。
β-半乳糖苷酶显色反应法：许多载体中含有β-半乳糖苷酶(lacZ)的调控序列和该酶N端氨基酸(α肽)的编码序列，并在这个编码区中插入一个多克隆位点，但没有破坏其可读框，也不影响其正常功能。大肠杆菌lacZΔM15突变株含有缺失N端编码序列的β-半乳糖苷酶基因(编码ω片段)。N端缺失的该酶单体不能形成有活性的四聚体，α肽可补足缺陷而恢复酶活性，称为α-互补。在含有IPTG和X-gal的培养基中，IPTG诱导产生有活性的β-半乳糖苷酶使培养基中的生色底物X-gal分解，产生半乳糖和深蓝色底物，故形成蓝色菌落。当外源DNA插入载体的多克隆位点中，破坏了α肽的可读框，α肽失活，失去互补能力，在同样的培养基上形成白色菌落，从而将二者区别开来。
β-半乳糖苷酶显色反应法可以将重组菌和非重组菌在同一平板上区别开来，而抗生素抗性基因插入失活法必须对照含有抗生素和不含抗生素的影印实验中在非抗生素平板上才可以得到，易被其他非抗性菌株污染和干扰。
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