发布时间 : 星期六 文章水稻TOS17突变体库的创建与应用更新完毕开始阅读a01032ce7e21af45b307a8f8
插入也有一些缺点如：可能会引起插入位点的重排、插入过程中T-DNA的边界序列容易缺失，并且组织培养容易激活其它元件如Tos17。
Tos17是水稻中的一个内源性的反转录转座子，全长4114bp，在栽培稻中含有1-5个拷贝(Cheng et al., 2006)，并且在日本晴中有两个原始拷贝，一个位于第7染色体上，具有转座子活性，另一个位于第10染色体上，没有转座子活性活性，而现在认为第10染色体上一段20bp的碱基缺失，造成其转座活性的缺失。Hirochika等(1996)在1996年发现了15个水稻品种“日本晴” 中的反转录转座子，其中Tos10，Tos17，Tos19在组培的条件下被激活，经过详细研究后发现Tos17具有以下特点：1.Tos17在组培的条件下激活，分化成植株后失活，因此Tos17插入引起的突变可以稳定遗传；2.Tos17的拷贝数随着组培的时间而增多，经5个月的组培后，可平均产生10个拷贝，可以通过组培时间的长短来控制转座的拷贝数；3.突变体产生过程不涉及转基因。4.Tos17是水稻内源性的反转录转座子，因此在插入植物基因组内部时，一般不会产生片段的缺失和改变，而且相对于T-DNA，Tos17突变体的侧翼序列的分离相对容易。因此Hirochika认为Tos17很适合用来构建插入突变体库。并构建了超过50,000个独立的再生植株，大约含有500,000个插入位点，并对M2代突变产生的表型进行了详细的分类(Miyao et al., 2003; 2007)，发现后代中大约50%的家系出现至少一个突变表型，在田间出现最多的表型是不育和矮化。但是Tos17突变体库也有一些缺点如其插入的拷贝数多，对以后的遗传分析不利；其产生的突变体只有10%是真正由Tos17的插入引起的，其余的突变体是在组培的情况下或是由其它的未知的转座子专座产生的。
Miyao等(2003)通过大量的Tos17的插入位点的分析发现，Tos17在水稻中的插入事件并不是一个随机的过程，存在热点，Tos17偏向于插入水稻中的较大的染色体，且插入密度和染色体大小高度相关。在染色体两端分布较多，在着丝粒附近和染色体中部分部较少。偏向于插入基因区，而极度不偏向插入转座子相关基因和基因间隔区以及基因调控区。偏爱于插入基因的编码区。并且偏爱于“Motor”, “Signal transducer”, “Transcription regulator” “Transporter” 等4类功能基因（Miyao et al., 2003; Piffanelli et al., 2007），因此利用Tos17比较容易获得饱和突变体库。 Ac/Ds转座子是McClintock于1948年在玉米中发现的。Ac是具有自主转座活性的元件，Ds是没有自主转座活性，需要Ac元件提供转座酶。因为Ac元件具有自
主转座活性，因此产生的突变遗传不稳定，不利于基因的分析，而Ds元件本身没有转座活性。因此人们提出了双组分系统。将Ac和Ds分别导入不同的植株，Ac经过了改造只能提供转座酶而无法转座，通过杂交的方法，将Ac元件导入含有单拷贝Ds的植株中，使Ds元件转座，然后再自交筛选不含Ac元件的后代。从理论上讲Ac/Ds元件是最理想的水稻插入突变体构建体系。产生的突变体通常是Ds元件的单拷贝的插入，大大方便了突变体表型的分析和基因的鉴定；Ds可以在导入转座酶的情况下重新转座，验证突变是由Ds的插入引起的；Ac/Ds双因子系统可用于转基因效率较低的籼稻品种，因为突变体是从Ac转座酶株系和Ds植株的有性杂交后代中筛选的，不需要大量的转基因工作；但是Ac驱动下的Ds可能发生的多次跳动所形成的痕迹(footprint)也可能影响突变表型的分析。 1.1.3.2 构建Gene Trap突变体
利用插入元件构建插入突变体同样存在一定的缺点，如：插入元件插入到一些植物生长发育的关键基因时，往往会导致插入致死；而且植物基因组存在大量是功能冗余的基因，敲除掉一个基因并不能产生表型的变化。针对这些情况人们通过对T-DNA进行一定的修饰，利用不同的原理进行基因功能研究。
Gene trap系统是基于报告基因的表达模式而研究外源DNA插入位点基因的表达及其功能的方法(Campisi et al., 1999; Jeon et al., 2000)，主要有三种类型：Enhancer trap，Gene trap和Promoter trap。在Enhancer trap 中，报告基因连接了一个小型的弱启动子，这个启动子通常包含一个TATA box 和一个转录启始位点，它并不能独立启动报告基因的表达，但是可以被邻近的增强子所激活。Promoter trap 和gene trap的报告基因不含启动子，因此只有当插入位点在转录单位内部并且位于正确的起始位点时报告基因才能表达。Promoter trap的报告基因的表达要求它插入到一个外显子中，从而形成一个可以转录的融合基因。Gene trap 中的报告基因安装了一个或几个剪接受点，因此即使报告基因插入到内含子中也能得到表达。相比而言，Enhancer trap中报告基因表达不像Gene trap和Promoter trap那样需正确方向插入，所以报告基因表达频率相对要高。但Enhancer trap存在远距离激活基因表达，不如Gene trap和Promoter trap容易鉴定和分离基因。本室已利用修饰的酵母转录因子GAL4/VP16成功地构建了水稻的Enhancer trap系，并且检测到报告基因GUS在各种组织中的表达率为25-59%(Wu et al., 2003)。Ito
等(2002)利用Ac/Ds 系统构建了水稻的Enhancer trap系，同时检测到10%的报告基因在各种器官的表达。
图2. Enhancer trap, Gene tarp和Promoter trap 载体结构示意图(Springer，2000)
Fig2. Structure of enhancer, gene and promoter trap vectors 1.2.3构建Activation tagging突变体
拟南芥和水稻测序完成后，拟南芥大约有三分之二的基因组是由染色体的大片段复制而来的，而且，大约由4000个基因是串联重复成两个或多个拷贝(Arabidopsis Genome Initiative, 2000)。在水稻不同的染色体上，其基因的重复比例约为15.4-30.4%(Goff et al., 2002)。因此T-DNA或转座子插入到这些基因内很可能得不到相应的表型。为了研究这类基因的功能，植物学家将T-DNA的边界构建了多个CaMV调节序列35S Enhancers和Promotors，来启动相邻基因的表达而得到功能获得性突变体(Hayashi et al., 1992; Suzuki et al., 2001)。一般认为，Activation tagging产生的突变体为显性或半显性的。这种基因的激活会引起一些新的表型，因此无论是功能冗余基因还是发育相关基因都能够通过表型来鉴定。目前，在水稻和拟南芥中都已经建立了Activation tagging的突变体库(Weigel et al., 2000; Jeong et al., 2002)，Zubko等(2002)用这种策略在矮牵牛中分离了与细胞色素合成
相关的Sho基因。拟南芥中也用该方法克隆了一些基因(Kakimoto et al., 1996; Kardailsky et al., 1999; Ito and Meyerowitz, 2000; Vander et al., 2000; Huang et al., 2001; Zhao et al., 2001)。
Fox-hunting突变体也是将基因超表达，从而获得显性和半显性突变体的一种方法。其原理是将全长cDNA，连接到含有强启动子的T-DNA载体上，从而使基因超量表达。Nakamura(2007)收集了水稻中的13980条独立的全长cDNA，在玉米的Ubiquitin-1的启动子下超量表达。得到了超过12000个独立的转化株系。大约16.6%的株系出现了突变表型，并且从中克隆一个新的赤霉素-2-氧化酶。 1.2. 4 突变表型的筛选
功能基因组的研究方法很多，归纳起来分为两类：一类，即正向遗传学(Forward genetics)，从一个突变体的表型开始，研究其基因是什么；反向遗传学(Reverse genetics)，从一个突变体的序列开始，研究引起什么样的表型的改变。 1.2. 4.1 正向遗传学筛选
插入突变体库构建完成后，就可以利用正向遗传学和反向遗传学进行基因的鉴定，而正向的突变体的筛选是一件很费时费力的事。Tos17是目前应用最为成功的反转录转座子，但多拷贝的插入是突变体的表型鉴定和分子鉴定较为困难，且只有10%左右的突变是真正由Tos17的转座产生的。Hirochika（2007）对其超过50,000份的Tos17突变体进行了大规模的表型筛选，将其突变表型分为53个大类。
1.2.4.2 反向遗传学筛选
利用反向遗传学筛选方法主要包括两种：一种是建立大型的侧翼序列信息库；一种是根据已知基因的保守序列设计一条基因特异引物，同对应的插入元件边界的特异引物组合扩增，如果外源片段插入到了目标基因内就应该可以得到PCR的扩增产物。该方法首先是在果蝇中应用，后来大范围的应用到各种生物中(Krysan et al., 1999)。现在主要是利用三维或二维的DNA混合池的方法来进行PCR筛选。如Kaneko等(2004)利用在大麦糊粉层细胞中分离的转录因子(GAMYB)的保守引物设计引物，筛Tos17突变体的DNA混合池，成功的分离到了在水稻中同源的GAMYB基因。
1.3 水稻插入突变体的侧翼序列的分离方法