发布时间 : 星期二 文章水稻TOS17突变体库的创建与应用更新完毕开始阅读a01032ce7e21af45b307a8f8
图10 接头PCR电泳结果
Fig 10 The products of Adapter-PCR amplification 3.4.2 侧翼序列的分析 侧翼序列的分类
得到侧翼序列后我们还要对侧翼序列进行分析定位到水稻染色体上，本研究主要利用Crossmatach程序，将所得到的侧翼序列与Tos17序列进行比对，排除掉Tos17原始序列对对比结果的干扰，再利用Blastn程序将所有的侧翼序列定位到水稻12条染色体上，以E-Value值10-5为界，E值小于10-5的侧翼序列被认为是能精确定位到水稻染色体上。利用Adapter-PCR的方法从Tos17左端分离侧翼序列，获得共获得侧翼序列160条，其中58条能精确的定位到染色体上，效率为16.25%。利用Adapter-PCR的方法从Tos17右端分离侧翼序列，共获得侧翼序列600条，其中543条能精确的定位到染色体上，效率为90.53%。利用Adapter-PCR从Tos17右端分离侧翼序列的效率要明显比从左端分离侧翼序列要高。插入位点相同的序列，我们认为是可能分化自相同的愈伤，我们只取每一插入位点的一条序列进行后续的分析，共计得到插入位点不同的序列524条，加入到后续的分析中。
为了有效的对侧翼序列进行管理，方便研究者查询，索取相应的突变体种子，
我们对侧翼序列进行了同一的编号。如编号“ATosR-08Z11AQ10_TosRS”。“A”代表分离侧翼序列的方法是接头PCR；“Tos” 表示该序列是Tos17侧翼序列，“R”代表分离侧翼序列是从Tos17右边界分离得到；“08Z11AQ10”表示突变体种子编号；“TosRS”代表测序引物。
3.4.2.1
Tos17 插入位点在水稻基因组中的分布
表中给出524条侧翼序列在水稻12条染色体的分布数目，可以看出Tos17可以插入到水稻所有的12条染色体上，而且Tos17侧翼序列在水稻12条染色体上的分布并不是一个平均的状态，存在一定的差异。我们通过计算Tos17插入数目与染色体长度的相关系数和Tos17在各条染色体上插入数目的理论值和实际值来证明Tos17的插入是否和染色体的长度相关。通过计算得出Tos17插入数目与染色体的长度的相关系数为r=0.717，说明Tos17插入数目与染色体的长度显著相关(P< 0.01)，卡方检测也证明了这一点(?2=13.77, P>0.1)。根据SR值显示的结果除第5染色体上Tos17的实际插入数目要显著少于期望数目，其它各条染色体的Tos17的实际插入数目和期望值没有显著的差异。说明染色体的长度是影响Tos17插入数目的一个因素。
表 Tos17 插入位点在水稻染色体上的分布
Tab Distribution of the Tos17 insertion on the rice chromosomes
Chrom.
58 49 50 60 25 49 50 40 35 31
Number of insertions
Observed 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Expected 61 51 51 50 42 44 42 40 32 32
-0.38 -0.28 -0.14 1.41 -2.62 0.75 1.23 0 0.53 -0.17
SRa
Chromosome Size(Mb)b 43.6 35.9 36.3 35.2 29.9 31.2 29.7 28.3 23.0 22.9
11 12 Total
a
32 44 524
40 39
-1.26 0.80
28.5 27.5 372.0
SR:standardized residue [=(Observed-expected)/√expected], which follows asymptot
ically a normal distribution (Dai and Zhang 1989). Thus an absolute SR value larger than 2.33 indicates statistical significance at P<0.01.
b
Data from TIGE( http://rice.plantbiology.msu.edu/)
3.4.2.2
Tos17在水稻基因组各区域中的分布
水稻全基因组测序和基因结构已基本完成(International Rice Genome Sequencing Project,2005)，根据TIGR的数据我们将水稻基因组简单的划分为三个区域：基因区(Genic region)，基因间隔区(Intergenic region)，转座因子相关区(TE-related region)。假设Tos17在水稻基因组中的插入是随机的，那么我们就可以根据这三个区域的大小得到期望插入的数目（基因区包括基因编码区，ATG上游1kb和翻译终止密码子下游500bp）。卡方检测结果证明(?2=210, P<0.005) Tos17在这三个区域内的分布并不是一个平均的状态。从SR值的计算结果来看，Tos17在基因区内的插入数目要显著高于期望值，而在转座因子相关区和基因间隔区要显著少于期望值。我们可以认为Tos17极度偏向插入基因的编码区而不偏向于插入基因的间隔区和转座因子相关区。
我们将基因区初步划分为编码区，ATG上游1kb区和翻译终止密码子下游500bp。同样通过卡方检测证明(?2=52.58517, P<0.005)Tos17的插入具有显著的偏爱性。SR值证明Tos17在基因编码区的插入要显著的高于期望值，而在ATG上游1kb区和翻译终止密码子下游500bp这两个区内要显著少于期望值。证明Tos17偏爱插入基因区(SR=4.55)而不偏向插入ATG上游1kb区(SR=-4.62)和翻译终止密码子下游500bp(SR=-3.25)这两个区。而基因的编码区又可以细分为外显子(Exon)和内含子(Intron)这两个区域。卡方测验(?2=11.4, P<0.005)证明Tos17插入数目在编码区内的分布也不是一个平均的状态，而且存在显著差异。通过SR分析发现Tos17在外显子内的插入数目要显著高于期望值，而在内含子内的插入虽然少于期望值但是没有达到显著水平。因此我们认为Tos17在基因编码区内显著
偏爱插入基因的外显子区域。
表. 524条Tos17标签在水稻基因组中各区间内的分布
Tab. Distribution of the 524 Tos17 insertions in different regions of the genome Test 1 2 3
a
Region Genicc TE-related Intergenic Coding 1kb upstream 500bp downstream Intron Exon
Number of insertion
389 55 80
Expected
226 90 208 269 116 59 185 159
SR
10.85 -3.68 -8.88 4.55 -4.62 -3.25 -2.29 2.48
a
Genome size(Mb)b 160.4 63.8 147.8 36.6 58.7 60.4 37.6 35.5
344 66 34 154 190
SR:standardized residue [=(Observed-expected)/√expected], which follows asymptot
ically a normal distribution (Dai and Zhang 1989). Thus an absolute SR value larger than 2.33 indicates statistical significance at P<0.01.
b
c
Data from TIGE( http://rice.plantbiology.msu.edu/)
The Genic, including coding region, 1 kb region upsteam the ATG and 500bp
downstream the translation stop codon.
3.4.2.3
Tos17在不同功能基因中的分布
524条非重复的Tos17侧翼序列，除去插入到转座因子相关区域中的61条序列，共计标记非重复的功能基因341个。其中有2个基因被插入4次，5个基因被插入3次，32个基因被插入两次。说明Tos17的插入存在一些热点基因。如基因 LOC_Os01g02860被插入4次，而在RiceGE网站(http://signal.salk.edu/ cgi-bin /RiceGE)上检索后发现该基因被Tos17插入多达10次以上。而用被插入的基因的检索本室RMD数据库(http://rmd.ncpgr.cn/)后发现, 被Tos17插入的341个基因中，仅有114个能找到T-DNA插入的等位突变体。说明Tos17和T-DNA在插入基因热点上有所不同。