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比较项目 设备需求 手工时间 抗体数量 提供的持久性 抗体质量 亲和专一性
单抗 多 多 大 长期 高 可高可低 多抗 简单 少 中等 短 低 多数专一性高 相对与多抗（抗血清）制备而言，单抗的制备较为复杂，且成本高，但是单抗也具有自身的优点：①用于制备单抗的目标蛋白纯度要求不高，1%的纯度即可制备。②针对目标蛋
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白可选择合适的单抗，可以选择目标蛋白质和抗体之间的结合常数Kd在10-10之间，易于解吸。③单抗供应周期长，不会象多抗的获取因为动物的死亡而中断抗体的供应。④吸附容量高：因为单抗是高度均匀的，因此专一性一致，而且结合强度可高可低，解吸可以控制。 免疫亲和层吸介质的制备有两种方法：（1）将抗体通过化学方法结合在层析介质上。（2）抗体蛋白质之间自己交联形成不溶于水的衍生物。
有关第一种方法可采用前面叙述的方法，如溴化氰法、双环氧化物法等，在这里就不一一介绍。这里将详细叙述一下第二种方法。
第二种方法是将抗体通过一种交联剂，如戊二醛、氯甲酸乙酯等，直接交联形成水不溶性的高聚物。所得高聚物可直接用于免疫亲和层析。戊二醛交联蛋白质中的NH2-，而氯甲酸乙酯交联的是蛋白质之间的-COOH。在交联时，一般加入惰性蛋白质，最常见的是牛血清蛋白（BSA），以降低成本。一般而言，BSA和抗体的比列为4:1，总蛋白质浓度控制在40-50 mg/ml。以IgG为例，说明其具体操作过程：
①将100 mg IgG（或其他抗体）及400 mg BSA，溶于10 ml 0.2 M 醋酸缓冲液（pH4.0）,
在搅拌下滴加加入2ml 2.5% 的戊二醛溶液。交联10-30分钟，出现凝胶，在室温下放置3小时。
②用10 mM磷酸缓冲液（0.15M NaCl, pH7.4）洗涤凝胶，将凝胶均质成小颗粒，然后分散在50 ml 0.1 M磷酸缓冲液中充分洗涤，直到洗涤液OD280小于0.05为止，再次均质并将凝胶分散在50 ml 0.2M HCl-甘氨酸缓冲液中（pH2.8），在室温下搅拌15分钟，离心收集凝胶。将凝胶分散在0.1 M赖胺酸或1M 乙二胺中，在4 ℃下保温过夜，再用缓冲液平衡后即可使用。
2．3．4．2免疫亲和层析的吸附和解吸
由于抗体和抗原之间的专一性较强，因此免疫亲和层吸的吸附作用力较强。吸附比较容易，但免疫亲和层析的解析却比较困难。
和染料亲和层析相类似，免疫亲和层析的解吸方法也可以分成特异性解吸和非特异性解吸两类。
特异性解吸一般采用小分子的半抗原，在接近中性的条件下，置换吸附的抗原。如对含有糖蛋白或多糖类抗原的免疫亲和层析，采用和抗原具有相似残基的小分子糖类如纤维二糖解吸。
非特异性解吸是目前最常用的免疫亲和层析解吸方法，主要有以下几种：
①调节pH：在pH低于4.0时，可减少抗体和抗原之间的作用力。但多数抗体对pH比较敏感，一般采用pH梯度(pH4.5到 pH1.5之间)进行梯度洗脱。
②采用脲和盐酸胍溶液：采用盐酸胍和尿素洗脱可破坏抗体和抗原之间的氢键，从而达到抗体和抗原解吸的目的。如Klein采用甘氨酸-HCl缓冲液（pH2.8）,0.1 M醋酸缓冲液、2M MgCl2、3 M尿素从Sepharose 免疫亲和柱子上解吸人免疫球蛋白IgG抗体。
③离子对：离子对是Hamaguchi等人1962年在研究DNA的盐变性时引入的，它主要描述疏水键的性质，在高浓度时，离子对可有效阻止免疫复合物的形成。Dandliker 系统地研究了离子对对抗体-抗原性解吸的影响，其影响次序为：SCN->ClO4>I- >Br->Cl-。如采用2 M NaI可解吸兔子的免疫球蛋白IgG，而且比pH2.2 甘氨酸-HCl洗脱效果好。 ④表面活性剂：非离子表面活性剂Tween 80, Triton X-100等可减弱抗体和抗原之间作用，因此也可以用于免疫亲和层析的解吸
⑤冷蒸馏水：用冷蒸馏水在低温及低盐浓度下，降低疏水作用，达到解吸目标。
2．3．4．3 免疫亲和层析的应用
表2 应用单克隆抗体进行免疫亲和层析的分离结果比较
纯化对象 人白细胞干扰素[24] 分离效果 所得干扰素蛋白成分主要位于分子量为15000~21000D的干扰素活性区域，产品的纯度大大提高，比活可达8×10IU/mg 抗人α2a型干扰素[25, 26] 人尿激酶[27]6将粗制品提纯到95%[25]，甚至到97%[26]以上 所得尿激酶制品比活为9×10~1.7×10-4-3 重组人生长激素 经高效液相色谱（HPLC）分析，描绘出单一峰，表明获得高纯度人生长激素 从表2中的分离效果来看，应用单克隆抗体进行免疫亲和层析后，只经过一次纯化就使目标产物的纯度有了大幅度的提高。
单克隆抗体亲和层析技术可以用来从体液、组织抽提液、细胞培养液中，特别是从基因工程菌体破碎液等复杂组成物中分离出微量蛋白质和多肽。由于其特异性高，操作简便而迅速，在高价值蛋白质和治疗多肽的下游处理过程中，作为一种良好的分离纯化工具，有较广泛的适用性。随着细胞融合技术的发展，可以利用的单克隆抗体越来越多，使得这一技术的应用更加广泛。
免疫亲和层析技术除了用于对目标产物的分离纯化外，近年来还发展了免疫亲和层析技术在其他方面如分析方面的应用。以下是一些应用例子：
⑴应用于植物激素的检测。植物激素的免疫测定技术发展迅速，它不仅用于微量的检测，而且免疫亲和吸附剂直接用于植物提取液的纯化，大大简化了激素的测定步骤。这种方法具有样品用量少、灵敏度高、特异性强的优点。
⑵与其他检测技术（如HPLC、荧光光度法等）联合使用，用于检测食品中的有毒有害物质。
2.3.5基团专一性大分子亲和层析
基团专一性大分子亲和层析是指用对某一类结构相近的物质有亲和性的大分子作为
亲和配基偶联在层析介质上进行亲和层析的层析技术。如Protein A对Ig G类似抗体有专一性，凝集素（如Con A）对糖蛋白有专一性。因此用基团专一性大分子亲和层析可同时纯化许多物质，而不需要更换配基。比较常见的基团大分子亲质基质有Protein A-Sepharose, Con A-Sepharose 等。小分子基团亲和配基包括染料、核苷酸等，这在前面已经讨论过了，这里主要讨论大分子基团亲和配基。
2． 3。5。1 Protein A 亲和层析
蛋白A (Protein A) 是一种细菌细胞壁蛋白质，在其被确定为蛋白质之前，被称为A抗原，和动物免疫球蛋白G(IgG)有很强的作用，结合在IgG分子的Fc片段。除IgG外，蛋白A还和IgM 和IgA也有亲和作用。对IgG 类似的抗体有专一性，主要用于IgG、IgG抗体片断以及用于相应抗原及免疫复合物的分离纯化。
目前作为配基使用的Protein A都是由发酵法获得的。Protein A亲和层析介质的制备和前面相同，一般将配基连接在溴化氰活化的Sepharose 上，合成的介质可耐受高浓度脲、盐酸胍等，在pH2-pH11.0下稳定。吸附蛋白的解吸一般采用：
①1 M 醋酸或柠檬酸缓冲液（pH2.0-3.0）
②0.1 M 甘氨酸-HCl缓冲液（pH3.0） ③3 M 异氰酸钾溶液
蛋白A亲和层析在抗体的分离纯化中应用较多如单抗的分离纯化。
蛋白A亲和层析在基因重组蛋白纯化中也有应用，类似固定化金属离子亲和层析的亲和尾方法。如在表达融合蛋白时，把Uhlen表达重组蛋白生产IGF-I时，表达了结合有蛋白A的融合蛋白ZZ-IGF-I，经过离心和过滤除去细菌后，将培养液上清液通过IG-Sepharose FF亲和层析柱，洗脱得到融合蛋白ZZ-IGF-I融合蛋白再经过裂解可得到IGF-I。
2.3.5.2 Con A 亲和层析
伴刀豆球蛋白A (Con A) 是从刀豆中分离出的一种植物凝聚素，它和含有D-甘露糖苷，葡萄糖苷的分子有亲和性，可用于糖蛋白、多糖和糖酯的分离纯化。还可以用于细胞器的分离纯化。此外，Con A 亲和层析还可用于血浆蛋白的分离纯化。如Con A –Sepharose 用于胎蛋白（fetoprotein） 的分离纯化，一步可纯化360倍。免疫球蛋白（Immunoglobin）是含有糖基的糖蛋白，可用Con A 亲和层析分离纯化。许多脂蛋白都含有一定量的糖，如人低密度脂蛋白等可以用Con A亲和层析纯化。许多激素和激素受体含有糖蛋白，都可用Con A来分离纯化。许多细胞膜表面的受体也是糖蛋白，也可以用Con A亲和层析分离纯化。
Con A 亲和层析的介质制备没有特殊之处，采用溴化氰法可将Con A交联到介质如Sepharose 上。
吸附平衡缓冲液应含有一定量的NaCl (0.5 M) ，而且需要Mn2+，Cu2+ (1 mM)等离子。 Con A 亲和层析的解吸一般采用竟争性配基洗脱，如采用甲基甘露糖苷或甲基葡萄糖苷进行梯度洗脱（0到0.5 M），结合太紧的蛋白可用低pH的硼酸缓冲液（0.1 M pH6.5）洗脱。 Con A亲和层析已成功地用于半乳糖转移酶，人乳糖蛋白等多个糖蛋白的分离纯化。 2．3．5．3肝素亲和层析
肝素是一种带有大量负电荷的非均一性的黏多糖，其分子量分布范围广，约为5 KDa到20KDa，广泛用于抗凝血作用。有肝素存在时，可以明显的提高抗凝血酶的活力。Lowell等于1974年最早使用固定化肝素分离纯化抗凝血酶，此后，肝素－Sepharose介质成功的用于分离具有碱性表面的蛋白质，如激素受体，生长因子，DNA和RNA聚合酶等。最近有报道使用肝素和固定化金属离子亲层析分离纯化出具有活性的Nef蛋白，该蛋白能够促进艾滋病病毒的繁殖[5]。
肝素亲和层析介质的制备方法简单，仍然可以采用溴化氰法偶联到Sepharose介质上，也可以直接从介质供应厂商（如Pharmacia）直接购买。
下面为肝素－Sepharose分离纯化抗凝血酶的实例。
①用0.15M NaCl，20mM 磷酸钠缓冲液平衡肝素－Sepharose凝胶。平衡后的凝胶以1：50（v/w）和血浆上清液混合吸附，吸附完全后的凝胶装填进色谱柱。
②用4倍柱体积的50 mM NaCl，0.2 M的磷酸钠缓冲溶液（pH7.0）洗脱，再用2.5倍柱体积的0.4M NaCl，20 mM磷酸钠缓冲液（pH7.0）洗脱。
③再用1.5倍柱体积2 M NaCl，20 mM的磷酸钠缓冲液（pH7.0）洗脱抗凝血酶，直到基线平衡。
④再依次用2倍柱体积的丙酮、6倍柱体积的去离子水再生层析柱。
参考文献：
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