发布时间 : 星期六 文章TALEN ZNF CRISPR更新完毕开始阅读a55246bf580216fc710afd5c
ZFN之间具有被称为―间隔区‖的spacer结构，该结构的长度以5～6bp为宜，7bp也能正常工作，合理的―间隔区‖设计才能保证ZFN二聚体拥有最佳的工作空间（图7）。
图7 ZFN特异性识别DNA并与DNA结合示意图。每个DNA识别域包含三个锌指，锌指从N端开始命名，在图中标示为F1、F2、F3。每个锌指结构分别与3个碱基发生直接接触，由此产生特异性。单独的FokI切割域不具有特异性识别能力，但当与锌指结构相连，并与另一个FokI切割域形成二聚体后，便能够对DNA双链进行切割。两个切割位点之间的距离约为4bp，如箭头所示。图片来源：Carroll D. (2011) Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genetics. 188(4): 773-82.
1.2 ZFN技术的初步应用及其机制
ZFN技术可用于基因组编辑。针对目的基因序列设计并合成ZFN后，使之对DNA进行特异性切割，从而形成DNA双链断裂区（Double-StrandedBreaks,DSB）；通过破坏非同源末端链接（non-homologous end joining, NHEJ）使目的基因失活，或借助同源重组
（homologous recombination, HR）等方式完成DNA的修复连接，可以使断裂的DNA双链重新黏合。将以上两步结合起来便可以完成一般的基因组编辑操作，具体机制如图8所示。
图8 通过ZFN技术对基因进行编辑操作的几种主要方式示意图。通过对靶基因编码区域的目标序列进行ZFN切割，可以产生DSB，导致基因无法通过NHEJ修复而失活，从而达到基因敲除的目的。通过在两端引入wildtype（野生型,WT）DNA模板，并借助于同源重组（homologous recombination,HR）的修复，整个表达元件（expression cassette）可以替换发生DSB的区域，从而可以修复具有致病性的突变基因。通过提供能够覆盖ZFN切割位点附近整个核苷酸多态性区域的DNA序列，同样可以利用同源重组实现基因的修复，箭头显示的是ZFN切割位点。图片来源： Palpant NJ, Dudzinski D. (2013) Zinc finger nucleases: looking toward translation. Gene Ther, 20(2):121-7.
ZFN技术具有重大的应用价值。在科研和农业领域，该技术既可用于基因的敲除失活，也可用于导入目标基因，使基因激活或阻断，或者人为改造基因序列，使之符合人们的要求。在医疗领域，经ZFN技术改造后导入治疗性基因的质粒或干细胞可被导入人体，实现基因治疗。此外，ZFN技术也可以直接用于有害基因的修补替换或是直接删除，以达到相关治疗目的。ZFN技术具有极佳的特异性和效率，因此能将基因/基因组错误修改的风险降到最
低。从理论上来说，研究人员甚至可以在任何物种中，对处于任意生长时期的细胞进行ZFN操作，可以自如地修改其基因，而还不破坏细胞状态。 2. ZFN技术的进展和应用
目前，除了传统的DNA重组技术外，合成具有可控特异性的锌指结构域的平台主要有两个：其一为Sangamo Bioscience公司所独有，在两个锌指的基础上生产更多 ZF的锌指核酸酶，并与Sigma公司合作，通过 Compozr项目销售预制的锌指；另一个是由锌指联盟（Zinc Finger Consortium）开发的 Oligomerized PoolENgineering（OPEN）技术，该技术主要通过大肠杆菌双杂交系统（E. coli two-hybrid selection system）来对ZFN进行筛选，这是一个开放平台，其模块化的锌指库和试剂皆可免费获得。
早期的 ZFN技术一般采用普通的 FokI-ZFN二聚体形式来保证其切割效率，但使用过程中可能因同源二聚体效应（homodimerization）而导致脱靶，影响切割特异性。Miller等人和Szczepek等人在2007年分别开发出FokI的变体，使得ZFN可以在异源二聚体
（heterodimer）形式下使用，从而在保证切割效率的前提下大大提升了特异性，并减少了细胞毒性，具有更优良的科研和应用价值。
ZFN虽然是刚刚兴起的技术，但已被越来越广泛地应用到科研和医疗领域中。ZFN技术的先导之一，Sangamo Biosciences公司正在和宾夕法尼亚大学合作，研究ZFN技术通过介导核酸酶引起CCR5基因座的破坏。这一研究成果在治疗HIV中具有广阔的应用前景，而且ZFN技术也已尝试应用于杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy）、21三体综合征等遗传疾病的基因治疗（图9）。
图9使用ZFN技术治疗艾滋病和遗传疾病的示意图。（上）治疗艾滋病：使用ZFN技术切割CCR5受体的编码序列，以破坏CCR5膜受体的功能，使HIV失去细胞感染能力。（中）治疗杜氏肌营养不良症：使用ZFN技术进行基因组编辑，插入小段序列将Dystrophin基因的读码框恢复正常。（下）治疗21三体综合征（唐氏综合症）：使用ZFN插入HSV的TK基因，直接造成一条21号染色体自发丢失；使用ZFN在一条21号染色体上插入Xist基因，使这整个染色体失去功能。图片来源：Hongmei Lisa Li, Takao Nakano, and Akitsu Hotta. (2014) Genetic correction using engineered nucleases for gene therapy applications. Development Growth Differentiation, 56(1): 63-77.
早期的ZFN技术需要借助病毒或质粒载体的方式进入细胞，之后再表达形成具有功能的蛋白。但Barbas等人发现ZFN可以依靠自身锌指部分跨过细胞膜进入细胞，并发挥作用，如此则可避免载体插入重要基因而引起突变等潜在风险。近年来，一系列应用ZFN所取得