发布时间 : 星期日 文章TALEN ZNF CRISPR - 图文更新完毕开始阅读a55246bf580216fc710afd5c
2013年初的《科学》第339卷第6121期连载了两篇具有重要意义的CRISPR技术论文，其中一篇描述的是麻省理工学院（Massachusetts Institute of Technology, MIT）Zhang的研究组使用CRISPR技术完成了多重基因组编辑，另一篇描述了哈佛医学院（Harvard Medical School）Church的研究组首次使用CRISPR技术完成了RNA介导的人类基因组编辑（图14）。他们使用基因工程学方式修改了细菌的II类CRISPR系统，并比较了这种新系统与传统TALEN方法在基因组编辑方面的效率差异，结果发现这种方式比TALEN有更快的时效性。同时，该研究组还建立了一个覆盖约40.5%外显子的基因组水平的gRNA群。
图14 使用一种基因工程修饰的II类CRISPR系统完成了人类细胞的基因组编辑。（A）人类细胞的RNA介导基因打靶涉及C末端包含SV40核定位信号（nuclear localization signal）的Cas9蛋白和一个或一个以上的向导RNA（guide RNA, gRNA）的共表达（上半部分共表达两个质粒的结构示意图），这一过程由人类U6聚合酶III（U6 polymerase III）的启动子介导。Cas完成DNA双链的解聚并在gRNA（guide RNA）的识别下切割特定的DNA双链位置，该过程前提是其3’端有序列正确的原间隔物模块（protospacer-adjacent motif, PAM）。原则上任何符合GN20GG序列模式的基因组序列都可以被特异性靶向识别（下半部分靶向识别的作用机制示意图）。（B）一个基因组整合的GFP编码序列被一个终止密码子和一个长达68bp的基因组片段在AAVS1位点的插入打断，使用合适的供体序列通过同源重组（HR）的方式修复GFP序列能诱使GFP功能恢复，形成GFP阳性的细胞，之后则可通过流式细胞术（FACS）分离。T1和T2向导RNA靶向序列定位于AAVS1片段区域。TALEN元件的两个单体的结合位点用上划线表示。图片来源：DiCarlo,
Julie E. Norville1, George M. Church. (2013) RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science, 339(6121): 823-826.
同年，中国科学院动物研究所周琪研究员利用CRISPR-Cas技术在大鼠中实现了多基因同步敲除；而怀特海德研究所（Whitehead Insititute）的 Jaenisch利用CRISPR-Cas技术构建了条件敲除的小鼠转基因模型；北京大学生命科学学院的瞿礼嘉教授课题组利用
CRISPR-Cas系统成功地实现了对水稻特定基因的定点突变；杜克大学Pratt工程学院基因组科学研究所的Gersbach研究组则已经开始尝试使用CRISPR技术进行基因治疗。仅这一年内，CRISPR/Cas领域就取得了如此多鼓舞人心的突破，简直可以用一日千里来形容了。
四、三种基因定点修饰技术的总结与比较
1. TALEN、ZFN和CRISPR/Cas的共同点
从分子生物学角度看来，基因定点修饰操作可以分为敲入（knock in）、敲除（knock out）、删失（deletion）及基因融合（gene integration）这几种类型。而其中敲除又有多重敲除（multiplex knockout）和条件敲除（conditional knockout）等特殊类型，本质上均是利用非同源末端链接途径（NHEJ）修复和同源重组（HR）修复，联合特异性DNA的靶向识别及核酸内切酶完成的DNA序列改变，其总体模式如图15所示。
图15 使用 TALEN、ZFN和CRISPR等技术的分子生物学途径示意图。图片来源：Tomoji Mashimo. (2014) Gene targeting technologies in rats: Zinc finger nucleases, transcription activator-like effector nucleases, and clustered regularly interspaced short palindromic repeats. Development Growth Differentiation, 56(1): 46–52.
近年来TALEN、ZFN和CRISPR/Cas三大基因定点修饰技术已经广泛应用于生命科学与医学的各个方面，包括但不局限于转基因动植物模型的构建、基因治疗及转基因育种等。虽然TALEN、ZFN和CRISPR/Cas三种技术在技术细节上有着各自独一无二的特色，但它们在各类应用中的基本模式却是相似的，例如在转基因大鼠的构建上，三种技术均是以显微注射的方式进入大鼠胚胎的（图16）。
图16 使用基因工程学方式构建基因靶向敲除大鼠的示意图。在大鼠（rat）胚胎中以显微注射的方式使用TALEN、ZFN和CRISPR等技术进行基因打靶。图片来源：Tomoji Mashimo. (2014) Gene targeting technologies in rats: Zinc finger nucleases, transcription activator-like effector nucleases, and clustered regularly interspaced short palindromic repeats. Development Growth Differentiation, 56(1): 46–52.
2. TALEN、ZFN和CRISPR/Cas的技术特点
虽然TALEN、ZFN和CRISPR/Cas均能用于与基因组定点修饰相关的各类操作，应用范围有很大程度的重合，但是这三种技术有各自不同的技术特点和适用范围（表1），因此实际操作中，实验者都会根据实际需要选择合适的基因组定点修饰技术方案。
表1 TALEN、ZFN和CRISPR/Cas三种基因定点修饰技术特点的比较
TALEN ZFN CRISPR/Cas9 靶点DNA序重复可变双残基（RVD）的重复 锌指（ZF）结构域 CRISPR RNA（crRNA） 或向列的识别区域 导RNA（gRNA） DNA的剪切 FokI核酸酶结构域 FokI核酸酶结构域 Cas9蛋白 通过搜索各类ZF组典型核酸酶8-31个重复可变双残基的拼接 合 数据库，拼接3-4的构建当时 个ZF 结构 克隆（或RNA合 成） gRNA的寡核苷酸合成 和分子所识别的靶（8-31 bp）* 2 位点大小 （9或12 bp）* 2 20bp + ―NGG‖ * 1 最小模块识1 别碱基数量 3 1 平台成熟、效率高于 靶向精确、脱靶率 低、细胞毒性优点 设计较ZFN简单、特异性高 被动同源重组 低、廉 价简便 细胞毒性、模块组装 过程繁琐、需缺点 设计依赖上下游序 靶区前无PAM则不能 切割、特要大量 测序工作、一般大型 公司列、脱靶率高、具有 异性不高、 NHEJ依然会产生随才有能力开展、 成本高 细胞毒性 机 毒性 表格来源：Hongmei Lisa Li, Takao Nakano, and Akitsu Hotta. (2014) Genetic correction
using engineered nucleases for gene therapy applications. Development Growth Differentiation, 56(1): 63-77.
TALEN技术是目前商业化最成功的技术，虽然将单个的TALEN模块进行组装需要大量的分子克隆和测序操作，十分繁琐，但是很多商业公司可以提供组装好的三联密码子TALEN模块，甚至四联密码子TALEN模块，这样就大大缩短了构建TALEN元件的实验周期。不过也正是因为如此，绝大多数实验室都难以自行完成TALEN技术的完整操作，对其推广造成了障碍。
ZFN技术则是最早被广泛使用的基因组定点修饰技术，各大平台均比较完善，有很多可以直接使用的资源，然而由于其自身的三联属性，其设计比TALEN更为繁琐，而且高度依赖于目标序列及其上下游序列，还具有脱靶率高及细胞毒性大等诸多限制性因素。
CRISPR/Cas技术摆脱了合成并组装具有特异性DNA识别能力蛋白模块的繁琐操作，其gRNA的设计和合成工作量远远小于TALEN和ZFN技术的DNA识别模块的构建过程，且