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深圳市集中空调系统军团菌污染状况分析 林爱红，梁焯南，张然，谭丽，唐屹君，李桂妹 (广东省深圳市疾病预防控制中心，518020)
摘要 目的 了解深圳市地铁和部分宾馆集中空调系统军团菌污染状况。方法 按照((公共场所集中空调通风系统卫生规范》要求，检测未经消毒处理的宾馆水样8份、专业消毒公司处理过的水样78份，未开通运营的地铁空调系统水样53份，用传统细菌分离培养法分离鉴定，用PCR法加以验证。结果78份消毒处理过的水样和53份地铁空调系统水样未检出军团菌；8份未经消毒处理的水样中检出1株嗜肺军团菌LP6型，3株LP1型，总阳性率为3.10%。结论 深圳市未经消毒处理的宾馆集中空调系统中嗜肺军团菌阳性率较高，专业消毒公司处理后的水样未检出嗜肺军团菌，建议有关部门加强对空调系统的监管，以降低嗜肺军团菌感染的隐患。 关键词 集中空调；PCR；嗜肺军团菌；mip基因
The research of Legionella Contamination in the Central Air Conditioning System of Shenzhen
Lin Aihong, Liang Zhuonan, ZhangRan, TanLi,Tang Yijun, Li Guimei (Shenzhen Center for Disease Prevention and Control , Guangdong, 518055 )
〔Abstract〕Objective To investigate the status of Legionella contamination in the central air conditioning system of some hotels and subway stations in Shenzhen. Methods According to the \from hotels,78 samples of water disinfected by professional company, 53 samples of subway stations not opened were detected, isolated and cultured with traditional method; PCR method was used to confirm the result. Results No Legionella was found in the 78 samples and 53 samples; 1 strain of LP6 and 3 strains of LP1 were found in the 8 samples. The positive rate was 3.10%. Conclusion The positive rate of Legionella was high in the central air conditioners of hotels that did not disinfected. The supervision to the central air conditioning system should be enhanced in order to eliminate the environment for the survival of Legionella.
Key words Legionella; Cooling water; Freezing water; Central air conditioner; PCR
（）
军团菌普遍存在于水和土壤中,尤其在供水系统、空调系统中较为常见1, 近年来的几次军团菌大的暴发流行多与空调系统冷却塔密切相关，集中空调冷却塔已被公认为军团菌的一个重
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要传染源2。深圳是一座现代化城市，高楼林立，气候炎热，宾馆、酒店普遍安装集中空调系统，军团菌病的隐患也相应较高，因此加强对空调系统冷却塔的监测很有必要。为了了解深圳市地铁和部分地铁集中空调系统军团菌污染状况,遂于2010年10-12月对上述单位集中空调冷却塔水样进行了军团菌检测，现将检测结果报告如下。
1材料与方法 1.1材料
1.1.1主要试剂：GVPC培养基（OXOID），BCYEa培养基（OXOID），军团菌诊断血清，（日本生研），PCR反应试剂、Goldview DNA染料和DNA Ladder Marker (TAKARA宝生物(大连)工程有限公司)，军团菌实时荧光检测试剂盒和嗜肺军团菌实时荧光检测试剂盒（深圳生科源技术有限公司）。
1.1.2主要仪器：
Biometra TProfessional Thermocycler PCR仪(德国Biometra公司); Mx3005P荧光定量PCR
1 ） 作者单位：深圳市疾病预防控制中心（广东 深圳 518055
作者简介：林爱红（1966-），女，硕士，主要从事微生物检验工作。
仪(美国Stratagne公司);二氧化碳培养箱(美国Thermo公司);干浴器(型号:MD一OZiV)，凝胶成像系统(DYY一8C电泳仪Bio1MAGING SYSTEM)。
1.2.3 引物与探针:针对嗜肺军团菌mip基因保守序列,设计属水平鉴定的5srRNA引物 L5SL9(5′-ACTATAGCGATTTGGAACCA-3′)和L5SLR93（5′-GCGATGACCTACTTTCGCAT-3′） 嗜肺军团菌巨噬细胞感染增强（mip）基因，扩增片段长度为650bp，序列为:
LmipL920(5′-GCTACAGACAAGGATAAGTTG-3′) 和LmipR1548(5′-GTTTTGTATGACTTTAATTCA-3′） 1.2方法
1.2.1水样采集和处理
从2010年10 - 12月，随机对深圳地铁2号线、3号线集中空调冷却塔冷却水采样，并接受某水处理公司空调水样和部分酒店空调水样。 1.2.2水样预处理
将水样静置沉淀，去除杂质。将经沉淀的样品通过孔径0.45μm滤膜过滤，取下滤膜置于5ml灭菌水中，充分洗脱，备用。
1.2.3热处理：取1ml洗脱样品置于50℃水浴加热30 min。
1.2.4酸处理：取1ml洗脱样品，再吸取等量的HCL-KCL缓冲液（0.2mol/L 3.9mlHCl+0.2mol/L 25mlKCl配成PH2.2缓冲液），稍微振荡混匀后静置10分钟，用0.1mol/L KOH终止酸处理，将试样pH调至7.0左右。 1.2.5军团菌的分离培养
洗脱样品、热处理样品、酸处理样品各0.1ml，分别接种GVPC平板，用L型玻棒将其在琼脂表面推开。将上述处理完毕的GVPC平板静置CO2培养箱,于37℃，5.0％CO2条件下培养1～10天，注意保湿。
1.2.6军团菌的培养鉴定 军团菌是革兰阴性杆菌，专性需氧，军团菌生长需要半胱氨酸和铁，不发酵也不氧化糖类，不还原硝酸盐，氧化酶试验阴性或弱阳性，尿素酶阴性，该菌生长的最适pH值6. 9-7. 0， 5. 0% CO2能促进部分菌株生长。
挑选在GVPC琼脂平板上呈灰白色，菌落形态符合，革兰染色为阴性细长杆菌者同时接种于BCYEa和血琼脂平板上，在BCYEa平板生长，在血平板上不生长者，初步可认定为军团菌。
通过初步鉴定的菌株进行生化试验，包括：氧化酶，硝酸盐还原，尿素酶、马尿酸盐水解，明胶液化等生化试验，然后用玻片凝集法进行血清凝集鉴定分型。 1.2.7 PCR鉴定方法 1.2.7.1模板处理
将水样洗脱液混匀后取1 ml到EP管，12 000 r/min离心5 min，弃去上清液留沉淀，加DNA提取液50 μ1，100℃干浴5 min，12 000 r/min离心5 min，上清液作为PCR扩增的模板。
1.2.7.2定性PCR扩增
总反应体系为25μl,包括Taq酶(5U/μl) 0.125μl,10×PCRbuffer(Mg2+free) 2·5μl,Mg2+1·5μl,dNTPs 2μl,上、下游引物各0.5μl,模板2μl,用ddH2O补足至25μl。
用5srRNA和mip两套引物分别扩增，PCR扩增在热循环仪上进行，循环参数为：加热至95℃，5 min；变性：94 ℃ , 45 s；复性：50℃1 min，延伸72 ℃ 1 min 20 s，35个循环，4℃保存。5srRNA预计扩增片段为105bp，mip预计扩增片段为650 bp。
2 ） 作者单位：深圳市疾病预防控制中心（广东 深圳 518055
作者简介：林爱红（1966-），女，硕士，主要从事微生物检验工作。
用GoldView DNA染料的1.5%琼脂糖进行凝胶电泳，用DNA Ladder Marker(100bp) 确定分子量大小。
1.2.7.3实时荧光PCR扩增
用嗜肺军团菌检测试剂盒进行实时荧光PCR扩增。体系和反应条件：反应体系为25μl，包括模板DNA 5μl，实时荧光PCR反应液各19.7μl，混合酶液0.3μl（Taq酶+UNG酶）。
反应条件为：UNG处理50℃2min,1个循环；95℃3min预变性，1个循环；PCR95℃5 s，55℃1min 40个循环。FAM通道采集荧光信号。
2．结果
2.1军团菌检出情况 深圳地铁2号线、3号线集中空调冷却塔冷却水53份和某水处理公司空调水样78份，传统方法和PCR方法均未检出军团菌和嗜肺军团菌；部分酒店空调水样8份，3份为嗜肺军团菌LP1型，1份为嗜肺军团菌LP6型。
部分酒店空调水样嗜肺军团菌检出情况 水样类型 客房热水 冷却水 冷凝水 泳池水
嗜肺军团菌LP1型（份） 嗜肺军团菌LP6型（份） 未检出嗜肺军团菌（份）
1
2 0 0
1 0 0 0
0 2 1 1
2.2 PCR结果 5SrRNA是军团菌属共有基因,高度保守,其rDNA序列拷贝作为属检测依据非常可靠。巨噬细胞感染增强蛋白(mip)是军团菌的主要毒力因子之一,在嗜肺军团菌抵抗宿主细胞内杀灭机制中发挥重要作用,mip基因序列可用作嗜肺军团菌种特异性靶序列来扩增。4株军团菌生化反应阳性的，PCR结果均为阳性。图1是4株阳性菌株PCR扩增产物的凝胶电泳图，图2是4株阳性菌株的荧光PCR图。
700bp 500bp 100bp
图1 4株阳性菌株PCR扩增产物的凝胶电泳图
备注：M·100 bp DNA分子量标准。1，2，3，8，15为mip基因阳性，4,5为阳性对照，6为阴性对照；7,9,10,11，16为军团菌属特异性基因阳性，12,13为阳性对照；14为阴性对照。
3 ） 作者单位：深圳市疾病预防控制中心（广东 深圳 518055
作者简介：林爱红（1966-），女，硕士，主要从事微生物检验工作。
1 2 3 4 5
6
7
图2 4株阳性菌株荧光PCR结果
备注：1，2，3，4，5为mip基因阳性，6为阳性对照，7为阴性对照。
3.讨论
军团菌是细菌性非典型肺炎三大病原菌之一，现已被WHO正式列入传染病报告范围。与
人类关系最为密切的是嗜肺军团菌，由它引起的肺炎，如未及时治疗，病死率很高。自1979年美国疾病预防控制中心命名军团菌以来，全球对军团菌的致病性研究已有30年。国内外对军团菌的研究证实军团菌病的流行及传播与集中空调、热水设备等现代生活设备的供水环境密切相关。近年来，我国上海、北京、广州
（3-5）
等地陆续报道在客房热水系统和集中空调系统的冷
却塔水中检出军团菌，检出率达30%～84%。
集中空调系统是军团菌生长繁殖的重要场所，本次检测了139份水样，总阳性率不高，与国内外空调水嗜肺军团菌检出率43%-50%相比明显偏低，究其原因，可能是：①深圳地铁2号线、3号线尚未投入运营，集中空调冷却塔基本没有开启，难以分离到嗜肺军团菌菌株；②某水处理公司是专业的集中空调冷却塔消毒企业，水样经消毒处理后嗜肺军团菌存活率极低；③酒店自送的8份水样检出4份嗜肺军团菌阳性，检出率达50%，与国内外报道数据相符，这说明深圳市未经消毒处理的集中空调系统嗜肺军团菌污染率很高。此外，4 份阳性样品中3份为嗜肺军团菌LP1型，1份为嗜肺军团菌LP6型。目前已知军团菌有49个种, 但90%军团病爆发是由嗜肺军团菌引起
（5-8）
，嗜肺军团菌的15个血清型中血清1型LP1型是引起社区获得性肺炎
4 ） 作者单位：深圳市疾病预防控制中心（广东 深圳 518055作者简介：林爱红（1966-），女，硕士，主要从事微生物检验工作。
和医院内感染性肺炎的重要病原体
（9）
。一旦冷却塔中LP1型军团菌达到一定浓度时，极易形成
气溶胶扩散至空气中引起人群感染军团菌病甚至暴发性感染。建议政府有关部门加强对公共场所集中空调的监管力度，以降低嗜肺军团菌感染的隐患。
参考文献
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5 ） 作者单位：深圳市疾病预防控制中心（广东 深圳 518055作者简介：林爱红（1966-），女，硕士，主要从事微生物检验工作。