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实验 16 赤霉素对 α - 淀粉酶的诱导形成
一、原理
种子萌发过程中贮藏物质的动员，需要在一系列酶的催化作用下才能进行。这些酶有的已经存在于干燥种子中，有的需要在种子吸水后重新合成。种子萌发过程中淀粉的分解主要是在淀粉酶的催化下完成的。淀粉酶在植物中存在多种形式，包括 α - 淀粉酶、 β - 淀粉酶等。 β- 淀粉酶已经存在于干燥种子中，而 α - 淀粉酶不存在或很少存在于干燥种子中，需要在种子吸水后重新合成。实验证明，启动 α - 淀粉酶合成的化学信使是赤霉素。萌发的大麦种子的胚产生赤霉素扩散到胚乳的糊粉层中，刺激糊粉层细胞内 α - 淀粉酶的合成。合成的淀粉酶进入胚乳，将胚乳内贮藏的淀粉水解成还原糖。因此，没有胚释放赤霉素的活动， α - 淀粉酶就不能合成。外加的赤霉素可以代替胚的释放作用，从而诱导 α - 淀粉酶的合成。这个极其专一的反应被用来作为赤霉素的生物鉴定法。在一定范围内，由去胚的吸胀大麦粒所产生的还原糖量，与外加赤霉素浓度的对数成正比。根据淀粉可与 I 2 -KI 显蓝色，而淀粉分解的产物还原糖不能与 I 2 -KI 显色的原理，可以定性和定量地分析 α - 淀粉酶的活性。 二、实验材料、试剂与仪器设备 （一）实验材料 大麦（或小麦）种子。 （二）试剂
1. 1 ％次氯酸钠溶液。
2. 0.1 ％淀粉溶液：取 1 g 淀粉和 8.16 g KH 2 PO 4 ，用蒸馏水配制成 1000 mL 溶液。 3. 2 × 10 -5 mol/L 赤霉素溶液：称取 GA 3 6.8 mg 放入烧杯中，加少量 95 ％酒精使其溶解，移入 1000 mL 容量瓶中，加水定容至刻度。然后再稀释成 2 × 10 -6 mol/L 、 2 × 10 -7 mol/L 和 2 × 10 -8 mol/L 三种浓度的赤霉素溶液。
4. 10 -3 mol/L 醋酸缓冲液（ pH4.8 ）：取 2 mL 0.2 mol/L 的醋酸 (11.55 mL 冰醋酸稀释至 1000 mL) 、 3 mL 0.2 mol/L 的醋酸钠 (16.4 g 无水醋酸钠配成 1000 mL) 和 1 g 链霉素，定容至 1000 mL ，每 mL 缓冲液中含链霉素 1 mg 。
5. I 2 -KI 溶液：取 0.6 g KI 和 0.06 g I 2 溶于 1000 mL 0.05 mol/L 的 HCl 中。 ( 三 ) 仪器设备
分光光度计，恒温振荡器，水浴锅， 2mL 移液管 1 支， 50mL 烧杯 2 只，试管 6 支，青霉素小瓶 6 个，镊子 1 把，刀片。 三、实验步骤
1. 取样 选取大小一致、完好的大麦或小麦种子 50 粒，用刀片将每粒种子横切成有胚和无胚的半粒，分装于 2 个烧杯中。
2. 表面消毒 向 2 个烧杯中加入 1 ％次氯酸钠溶液，以浸没种子为度。消毒 15 min 后，用无菌水冲洗 3 次，备用。
3. 处理浓度 将 6 只青霉素小瓶编号后，按表 40 – 1 加入溶液和材料。溶液混匀后， 1 ～ 6 号小瓶中赤霉素的最终浓度分别为： 0 、 0 、 2 × 10 -5 、 2 × 10 -6 、 2 × 10 -7 和 2 × 10 -8 mol/L 。将青霉素小瓶置于恒温振荡器中于 25 ℃下振荡培养岳阳家政24 h 。
表 40-1 处理浓度及方法
青霉素小瓶编号 1 2 3 4
赤霉素溶液 浓度（ mol/L ） 0 0 2 × 10 -5 2 × 10 -6 mL 1 1 1 1 醋酸缓冲液 (mL) 1 1 1 1 实验材料 10 个无胚半粒 10 个有胚半粒 10 个无胚半粒 10 个无胚半粒
5 6
2 × 10 -7 2 × 10 -8 1 1 1 1 10 个无胚半粒 10 个无胚半粒 4. 淀粉酶活力分析
培养完毕后，从每个小瓶中吸取 0.1 mL 溶液，分别加到事先盛有 1.9 mL 0.1 ％淀粉溶液的试管中排毒养颜胶囊，摇匀，在 30 ℃恒温水浴锅中保温 5 min 后，用滴管各取出 1 滴反应液于白瓷板的 6 个穴中，滴加 1 滴 I 2 -KI ，观察显色情况，比较各穴中颜色的差异。若有显色差异，则取出试管各加 I 2 -KI 溶液 2 mL 和蒸馏水 5 mL ，充分摇匀，于分光光度计上在 580 nm 波长下，以蒸馏水作空白对照，测定各试管反应液的吸光值 A ，比较 A 值的差异。若用白瓷板显色时差异尚不明显，则继续保温反应，直至在白瓷板上有显色差异为止。以 A 值从标准曲线上查得溶液中淀粉的含量，以被分解的淀粉含量衡量淀粉酶的活性。标准曲线可用不同浓度 (0 ～ 7μg/mL) 淀粉溶液与 I 2 -KI 显色反应后所测得的吸光值绘制。 四、结果计算
绘制赤霉素浓度与淀粉酶活性关系曲线，淀粉酶活性以被水解淀粉的含量表示。第 1 瓶为淀粉的原始量 (X) ，第 2 瓶为带胚半粒种子反应后淀粉的剩余量 (Y) ，第 3 ～ 6 瓶为无胚半粒种子加入不同浓度赤霉素溶液反应后淀粉的剩余量 (Y) 。
被水解淀粉的含量 ( ％ )=[(X-Y) ／ X] × 100
[ 思考题 ]
（ 1 ）实验中为何要用 1 ％次氯酸钠溶液处理小麦种子 ? 为何要在醋酸缓冲液中加入链霉素 ?
（ 2 ）本实验为何要将小麦种子分成有胚和无胚的半粒 ? 为何 1 号和 2 号怎么减肚子瓶中都没有加入赤霉素溶液，但反应完后两者溶液的吸光值却不同 ?