发布时间 : 星期一 文章实验七 流式细胞仪检测技术更新完毕开始阅读af4db60a844769eae009eda0
24孔培养板，0.5ml/well。
每孔加20ug/ml LPS0.15ml，37度，5%CO2孵育36~48小时。
③此时培养上清内含巨噬细胞分泌的高水平IL-1，收集培养上清，12000r/min离心15分钟，将上清移入新的1.5ml试管中，-20度冻存。 （2）IL-1的生物学活性测定
①胸腺细胞的制备：颈椎脱位处死小鼠，无菌取胸腺至于平皿中，加入5ml10üS-IMDM培养液，200目不锈钢网制成单个细胞悬液；1500r/min离心10分钟，再用5%Hank’s液洗涤细胞2次后，重悬于10üS-IMDM培养液中，调细胞浓度为1.0×107/ml。
②加样：取胸腺细胞加入96孔细胞培养板，0.1ml/well。再加入IL-1待测样品或IL-1标准品，50ul/well，实验孔再加入50ul ConA（终浓度0.625ug/ml），同时设培养液对照孔（0.1ml细胞+0.1ml培养液）、ConA对照（0.1ml细胞+50ul培养液+50ul ConA），均设3复孔。37度，5% CO2孵育36~60小时。
③3H掺入：每孔加1.85×1010uBq/20ul（0.5uCi/20ul）3H-TdR，继续培养8小时。 ④测定：多孔细胞收集器收集细胞于玻璃纤维滤纸上，用β液体闪烁仪测定3H-TdR
掺入量（cpm）以净cpm值（实验孔- ConA对照孔cpm值）为纵坐标，对应的不同稀释浓度IL-1标准品为横坐标，在半对数图纸上绘制出标准曲线，再从标准曲线上查出待测样品中的IL-1含量。
关键点
（1）吸取LPS刺激的小鼠巨噬细胞培养上清时，必须离心，以除去细胞及细胞破碎成分。
（2）ConA应选择淋巴细胞转化实验的亚剂量，即选择能够激活胸腺细胞，又不引起明显增殖的量，如果ConA过量，则不能有效反应IL-1的刺激活性。
二、IL-2生物学活性检测
白细胞介素-2（IL-2）是由活化的辅助性T细胞分泌的一种细胞增殖因子，具有促T细胞增殖和维持T细胞体外长期生长的作用。CTLL-2为IL-2依赖细胞株可用作IL-2生物学活性定量检测。本实验采用MTT分析法，通过测定CTLL-2细胞的增殖量，确定IL-2生物学活性单位。检测IL-2的生物学活性，可以间接了解辅助性T细胞的功能。
试剂与材料
（1）1）10üS-RPMI-1640培养液，含2mmol/L谷氨酰胺、25mmol/LHEPES、10U/ml
青霉素、100ug/ml链霉素。
（2）MTT（4，5-dimethythiazoyl-zyl2,5-diphenylterrajolium bromiole）用PBSA缓冲液配制成1mg/ml浓度工作液，4度避光保存。 （3）IL-2标准品。 （4）PHA（200ug/ml）。 操作流程
（1）人外周血T细胞分泌IL-2的诱生：
①人PBMC分离：采用常规淋巴细胞分层液浓度梯度离心法分离PBMC，用10üS-RPMI-1640培养液调整细胞浓度为
加样：接种细胞悬液于24孔培养板，每孔0.5lml，每孔再加PHA0.5ml，37度，5% CO2孵育48小时。
③回收上清：吸出细胞培养上清，12000r/min离心15分钟，收集上清，-20度冻存。 （2）IL-2生物活性测定
①CTLL-2细胞制备：取传代培养24~48小时对数生长期的CTLL-2细胞，用培养液离心洗涤2次，每次1000r/min离心5分钟，再用10üS-RPMI-1640培养液调制细胞浓度为1×105/ml。
②加样：将细胞接种于96孔培养板，每孔0.1ml。同时将待测样品和标准品做倍比稀释，每孔加入0.1ml，每个稀释浓度均设3复孔。另设培养液对照孔（100ul细胞+100ul培养液）。37度，5% CO2孵育40小时。
③MTT掺入：轻轻吸取上清液100ul，加MTT（1mg/ml）100ul，37度，5% CO2孵育2小时。
④测定：离心培养板，2000r/min，5分钟，吸弃上清液，每孔加100ulDMSO，作用30分钟，用酶标测定仪于波长570nm测吸光值（A）。
⑤计算：用标准品浓度和对应的净A570nm值（实验孔-阴性对照孔的A570nm值）绘制标准曲线。根据标准曲线求出待测样品IL-2水平。
关键点
（1）CTLL-2细胞存活率应大于95%。
（2）因标本中含IL-4等，可影响IL-2的测定，最好采用抗IL-4mAb吸附剂除去IL-4。
三、IL-4生物学活性检测
IL-4主要是由TH细胞活化后产生的一种细胞因子。CT.4S细胞为IL-4的依赖细胞株，
对IL-2呈现低反应性，其增殖反应与IL-4的活性呈正相关系。检测IL-4的生物学活性水平，可间接了解TH2细胞及与抗体介导的一些体液免疫的功能。
试剂与材料 CT.4S细胞株，A23187（钙离子载体）（用生理盐水配制成0.1ug/ml浓度）。其他同IL-2测定。 操作流程 （1）IL-4诱生
①人PBMC分离：淋巴细胞分层液常规分离PBMC，用10üS-IMDM培养液调细胞浓度为1×106/ml。
②加样：将细胞接种于24孔细胞培养板，每孔0.5ml。再分别加0.25mlPHA（200ug/ml）和0.25A23187（0.2ug/ml），37度，5% CO2孵育24小时。
③回收上清：将细胞培养板1500r/min离心10分钟，收集细胞培养上清液，-30度冻存。 （2）IL-4生物学活性测定
CT.4S细胞悬液制备 ①
接种细胞于96孔培养板 ② 加待测样品和标准品 ③
加3H-TdR ④
收集细胞，测定3H-TdR掺入量 ⑤ 绘制标准曲线，计算待测样品的IL-4的活性单位 ⑥ *注：
①用0.25%胰酶消化、收集生长旺盛的贴壁CT.4S细胞；经Hank’s液离心洗涤2次后，10üS-RPMI-1640培养液调制细胞浓度为1×105/ml。 ②接种细胞于96孔细胞培养板，每孔0.1ml。
③加入适当稀释的待测样品和标准品，每孔０.１ml。每个样品设３个复孔，同时设培养液对照。37度，5% CO2孵育４８小时。 ④与⑤同IL-2。
⑥以cpm为纵坐标，对应的不同稀释浓度IL-4标准品浓度为横坐标，在半对数图纸上绘制出标准曲线，再从标准曲线上查出待测样品中的IL-4含量。
关键点 在IL-4诱生过程中，常同时产生一定量的IL-2，将影响IL-4的检测结果。因此，最好采用IL-2mAb吸附剂除去IL-2。
四、IL-6生物学活性检测
MH60.BSF2为IL-6依赖细胞株，MH60.BSF2细胞增殖量同IL-6的生物学活性呈正相比。
试剂与材料 同IL-2的生物学活性检测。 操作流程
（1）IL-6的诱生：诱生过程与IL-2基本相同。用于诱导产生IL-6的细胞可用PBMC。诱生剂用PHA。
（2）IL-6的生物学活性测定：采用MH60.BSF2细胞增殖法，测定过程IL-2。应用的MH60.BSF2细胞浓度为2×105/ml。
五、IL-8生物学活性检测
IL-8 中对中性粒细胞具有激活和趋化作用，通过检测中性粒细胞的迁移距离可以确定IL-8的生物学活性，即对中性粒细胞的趋化活性。
试剂与材料
（1） 6%右旋糖酐生理盐水溶液。
（2） 淋巴细胞分层液比重为1.077+（-）0.001。
（3） 2%琼脂糖：称取2g琼脂糖，加入到100ml蒸馏水中，煮沸溶解。 （4） 0.1%白明胶Hank’s液。
（5） DMEM培养液（2×浓缩），内含20üS和0.75mg/mlNa2CO3溶液。 （6） 甲醇溶液、Wright-Giemsa染液。 （7） 洁净载玻片。
（8） 打孔器，直径为3mm。 操作流程 （1）IL-8的诱生
① 常规分离PBMC，洗涤后，调细胞浓度为5×106/ml。 ② 将细胞接种于24孔细胞培养板，每孔0.5ml。