发布时间 : 星期日 文章高中生物：5.3《血红蛋白的提取和分离》学案(2)(新人教版选修1)更新完毕开始阅读b1cca944ce1755270722192e453610661ed95a25
课题3 血红蛋白的提取和分离
一、学习目标：
本课题尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，使学生能够体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法，电泳法等分离生物大分子的基本原理，为今后学习运用这些技术打下基础。
二、重点：
凝胶色谱法的原理和方法
三、难点：
样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。 【基础梳理】 一、凝胶色谱法
1、概念：也称做 ；是根据 分离蛋白质的有效方法。 2、原理
（1）由 构成的凝胶，内部有许多贯穿的的 。
（2）当 不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量 的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程 ，移动速度 ，而相对分子质量 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在 移动，路程 ，移动速度 ，从而使 不同的蛋白质分子得以分离。 二、缓冲溶液
1、作用：在一定范围内，抵制 的 对溶液pH的影响，维持pH 。 2、配制：由 种缓冲剂溶解于 中配制而成，通过调节缓冲剂的 就可以得到不同pH范围内使用的缓冲液。 三、电泳
1、概念：指 在电厂的作用下发生 的过程。
2、原理：在一定的 下， 、 等生物大分子的可解离基团会带上 或 ，在 的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷 的电极移动。
3、作用：电泳利用了待分离样品中各种分子 的差异及分子本身的 、 的不同，使带电分子产生不同的 ，从而实现样品中 的分离。
4、方法：常用的电泳方法有 和 。测定蛋白质分子量时通常使用 。 四、实验操作
1、样品处理:通过 、 、 等操作收集血红蛋白溶液。
(1)红细胞的洗涤：目的是 。分离时采取 ，直至上清液中没有 ，表明红细胞已洗涤干净。
(2)血红蛋白的释放：在 和 的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。
(3)分离血红蛋白溶液：把 离心后，将试管中的液体用 过滤、除去 ，于 中静置片刻后，分离出下层的 。 2、粗分离：即透析
(1)方法：将血红蛋白溶液装入 ，将 放入一定量适宜浓度的 中，透析 。
(2)目的：将 的杂质除去。
(3)原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子物质保留在袋内。 3、纯化:通过凝胶色谱柱将相对分子质量较大的杂质蛋白除去。操作如下： (1)凝胶色谱柱的制作。
(2)凝胶色谱柱的装填
①材料：本实验使用的是 。
②方法：凝胶用 充分溶胀后。配成 ，一次性 倒人色谱柱内。不能有 存在；不能发生 流干露出凝胶颗粒的现象。 (3)样品的加入和洗脱
①a、准备：加样前，打开流出口，使柱内凝胶面上的 缓慢下降到与 平齐，关闭出口。
b、加样：用 小心地将1mL透析后的样品加到 的顶端，注意不要破坏 。
c、加样后：打开下端出口，使样品渗入 内。 ②洗脱：加入 ，打开下端出口，进行 。
4、纯度鉴定：在鉴定的方法中，使用最多的是 。五、操作提示
1、红细胞的洗涤： 、 与 十分重要。 过少，无法除去血浆蛋白； 过高和 过长会使 等一同沉淀，达不到分离效果。
2、色谱柱填料的处理：商品凝胶使用前需直接放在 中膨胀，可以将加入其中的
用 加热，加速膨胀。
3、凝胶色谱柱的装填：在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的 ，降低 。
4、蛋白质的分离：如果红色区带 地移动，说明色谱柱制作成功。 【探究归纳】
一、人们用鸡的红细胞提取DNA，而用人成熟的红细胞提取血红蛋白的原因是什么?
二、洗涤红细胞时为什么不能用蒸馏水代替生理盐水?
三、在血红蛋白释放过程中。加入蒸馏水和甲苯的目的是什么?
四、凝胶色谱法的原理归纳
【典例导析】
类型一 凝胶色谱法分离蛋白质
【例l】凝胶色谱技术是一种快速而又简单的分离技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果，目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛应用，不但应用于科学实验研究，而且，已经大规模地用于工业生产。据图回答问题：
（1）a、b均为蛋白质分子，其中先从层析柱中洗脱出来的是 ，原因是
。
（2）自己制作凝胶色谱柱时，在色谱柱底部d位置相当于多孔板的结构可由 替代。
（3）装填凝胶色谱柱时，色谱柱内不能有气泡存在，原因是 。
（4）洗脱用的液体应尽量与浸泡凝胶所用的液体 (填“相同”或“不同”)，洗脱时，对洗脱液的流速要求是 。
【思路点拨】用凝胶色谱技术分离各种大分子物质时，大分子物质先洗脱出来，然后是小分
子物质。大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布于颗粒之间，所以向下移动的速度较快。小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶颗粒内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质从而落后于大分子物质洗脱出来。在色谱柱中装填凝胶的时候要尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。一是在装填凝胶柱时，不得有气泡存在，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。二是凝胶色谱操作过程中，不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。一旦发生上述两种情况，凝胶色谱柱需要重新装填。 互动探究
(1)凝胶色谱柱的直径大小会影响分离的效果吗? (2)题目中a和b的分离度与凝胶色谱柱的高度有关吗?
(3)除了题目中提到的气泡需要重装以外，还有哪种情况需要重装？ 类型二 探讨电泳的原理
【例2】蛋白质分子中，氨基酸的α-氨基和α-羧基虽然大部分结合成为肽键，但是蛋白质分子内仍含有各种酸性基团和碱性基团，如肽链末端的α-氨基和α-羧基、天冬氨酸和谷氨酸残基中的羧基、赖氨酸和组氨酸残基中的各种碱性基团，所以蛋白质是两性电解质。在酸性溶液中，碱性基团的解离增大，使蛋白质带正电荷；在碱性溶液中酸性基团的解离加强，使蛋白质带负电荷。当溶液到达某一pH时，蛋白质可因内部酸性和碱性基团的解离相等而呈等电状态，这时的溶液pH叫做蛋白质的等电点。不处于等电点状态的蛋白质分子的正、负电荷量是不相同的。试回答下列问题：
(1)多数蛋白质的等电点近于5，一般含碱性基团较多的蛋白质的等电点 (“偏高”还是“偏低”)。
(2)根据等电点的不同，你能用 方法将不同种类的蛋白质分子分开。 (3)简述根据等电点分离不同种类的蛋白质分子的原理。
【思路点拨】本题深入到蛋白质内部，从蛋白质分子带电性质及数量的角度，引导学生理解电泳法分离蛋白质的原理。含碱性基团较多的蛋白质溶液，在pH近于5时解离程度较大， 蛋白质带正电荷。要使蛋白质内部酸性和碱性基团解离相等呈等电状态，必须提高溶液的pH，使酸性基团解离增加，故蛋白质的等电点提高。根据等电点不同，可以利用电泳法将特定的蛋白质分离出来。
【提能演练】