发布时间 : 星期五 文章半夏蛋白的提取分离、含量测定及对Hela细胞的作用研究更新完毕开始阅读b4951231ed630b1c59eeb59f
浙江理工大学硕士学位论文
表2.5四种不闻方法提取的半夏总蛋白含量《定结果 Table 2.5 Results ofdetermation of total
protein content in PinelUa ternata extracted by four different
methods
编号 I 浓度(mg/mL) (n=\ 浓度(mg/mL) (n=2) 0.383 0.713
浓度(mg/mL) (n=3) 0.399 0.369 0.678
2 3
4
0.655
1.004
1.082
0.493
1.185 0.578
0.507
注：I:丙飼沉淀法2: 95%(NH4)2S04盐杴法3: TCA-丙觸法4: Tris-饱和紛法
由标准曲线可以计算三次重复四种方法提取的半夏总蛋白浓度，结果如表2.5所示。 由表2.5可知,重复一实验中四种方法提取的半夏总蛋白含量为TCA-丙銅法(1.082
mg/mL) >950/0 (NHj)2SO4 娃杴法(0.678 mg/mL)>Tris-饱和盼法(0.493 mg/mL)>丙雨法(0.369 mg/mL),重复
实验二和三的结果趋势和重复实验一符合，四种方法提取总蛋白含量的关系 为TCA-丙飼法>95。/。(NH4)2SO4盐杴法>Tris-饱和盼法>丙雨法,与i5?/o SDS-PAGE电泳 检测结果一致，从蛋白电泳行为和蛋白浓度两方面推定TCA-丙爾法是最佳的半夏总蛋白 提取方法，故半夏总蛋白的提取采用TCA-丙雨法。
2.4 讨论与小结
半夏蛋白是半夏重要的有效成分之一’具有重要的药理作用，半夏总蛋白的含量高低 直接反应半夏质量的好坏。半夏总蛋白的提取没有确定的方法，目前最常用的方法是
(NH4)2S04分段盐杴法，此法只能提取某一饱和度(NH4)2S04下半夏的总蛋白，孙光星等6n 用
【
生理盐水为提取液用丙飼沉淀的方法提取掌叶半夏总蛋白，但本实验发现，该法不能充 分提取半夏总蛋白。
植物总蛋白的提取方法有多种，需要根据不同的实验材料选取不同的实验方法。本实 验对植物总蛋白提取最常用和经典的四种方法提取的半夏总蛋白质量进行比较分杴，寻找 半夏总蛋白提取较优的方法。四种方法各有优劣，最方便省时的是丙雨沉淀法，最费时的 是Tris-饱和粉法，TCA-丙銅法相对最省时。关于半夏总蛋白提取的细节，半夏样品要充 分研磨成细粉，使蛋白更容易溶出’四种方法所用的材料要完全相同，取自同一样品，避
免材料差异引起的误差。同时要设帄行实验组，排除提取时操作失误造成的结果不准确，
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提取的总蛋白溶液要定容至同一体积，以便后续实验分杴。
对四种方法提取的半夏总蛋白分别进斤SDS-PAGE凝胶电泳和Bradford蛋白含量测定 分杴，SDS-PAGE凝胶电泳时四种方法提取的总蛋白上样量要一样，以便比较分杴电泳结 果。SDS-PAGE凝胶电泳结果显示四种方法的半夏总蛋白电泳行为差别不大，蛋白条带都 主要出现在12kDa和24kDa处，在35 kDa处也有条带出现，但条带浓度则有明显差异， TCA-丙雨法和95% (NH4)2S04盐杴法提取的半夏总蛋白电泳条带相对浓于丙飼沉淀法和 Tris-饱和粉法提取的半夏总蛋白。
总蛋白浓度的测定也影响着对四种方法的分杴结果，本实验采用Bradford蛋白含量测 定试剂盒对提取的蛋白浓度进行测定，该法不受绝大部分样品中的化学物质的影响，样品 中琉基乙醇的浓度可高达I M’ DTT的浓度可高达5 mM, Tris.糖、甘池、氛、EDTA 等均不千扰测定。根据该法测定浓度的范围及SDS-PAGE凝胶电泳结果取合适体积的总蛋 白溶液用于含量测定，TCA-丙酬法提取的总蛋白溶液取50 hL,其余三种方法提取的总蛋 白溶液各取100 ^iL,然后用PBS稀释至500 ^L,测定结果均在该法测定的标准曲线线性 范围内。总蛋白的含量测定结果显示，四种方法提取的半夏总蛋白浓度的大小为TCA-丙 飼法>95% (NH4)2S04盐杴法>Tris-饱和紛法>丙飼法，两种检测方法结果相结合说明， TCA-丙雨法无论从提取总蛋白的成分和总蛋白的含量上说都是较优的。本实确定TCA-丙 雨法为提取半夏总蛋白的方法，为后续实验研究奠定基础。
第三章不同时期半夏总蛋白含量变化的动态分杴
半夏是中国的传统中药，半夏蛋白是半夏主要的有效成分之一，具有抗肿瘤、抗生育、 杀虫等重要的药理作用和生物学特性，可以应用到药学、免疫学、植物保护、医学和基因 工程等方面。半M白己成为半夏研究■点之而半夏资源紧缺，半Mfi的获得也 由天然蛋白向基因表达生产半夏蛋白转变，但是，基因表达的蛋白与天然蛋白的活性还有 -定的差j?。S此，更好的方法是充分酬半夏顿天然蛋白。 显然，研究半夏总蛋白的动态变化则是种新的途径。本文研究半夏不同生长时期总蛋白含 量的动态变化，不同生长时期半夏总蛋白成分的变化，为半夏药用成分的监控及合理采收 提供数据，为充分利用半夏研究半夏蛋白的分离纯化、晶体结构、药理作用奠定基础，同 时也有助于利用不同半夏蛋白成分开发和研制新型抗肿瘤苑物。
3.1实验材料、器材与试剂 3.1.1实验材料 闻 2.1.1 3丄2实验器材
电子天帄；连续波长生物分杴仪 3
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丄3实验^剂及其配制 参考2.1.3 3.2实验摊 3.2.1材料处理
1) 选取大小均一、形状相似、直径2-2.5 Cm、帄
均质量为3.5 g的半夏块基；
2)
将半夏置于铺有珍珠岩的透气碟子里，于25
T光照温室里催芽至芽发fig阿，期间 要注意
珍珠岩湿度，保证半夏块基发芽所需水分，同时还要注意珍珠岩的透气性。 3.2.2半夏的种植
1) 2) 3)
在温室外选取肥沃的的土壤，杳土整鞋淺水；
于3月下旬播种催芽块莲，播种深度为5-lOcm,间距为10cm;
播种后要经常除草，避免草荒，经常杳土饶水，避免土壤東结千旱，雨水过多时及时 排
水，避免积水造成块莲腐烂；
3.2.3半夏不同生长时期样品采集及处理
2)
1)
分别于半X出芽期、mrnmmM.inmm,并记录。
将采集到的样品帄行分为两组，一组块！去皮后千燥处理，一组为新鲜样品，对干
燥 处理和新鲜祥品分别提取总蛋白。
3.2.4 半夏总蛋白的提取 参考2.2.1 祥品处理： 1)
新鲜组样品出芽期、全苗期、珠芽期、佛焰奄期、倒苗期块蓬切成小碎块加液氨后
充 分研磨成粉末，分别取0.78 g、1.32 g、1.17 g、1.15 g、1.4 g粉末，根据取样量的多少分 别加入3^4 mLTCA-丙ffi提取液，-20 °C静置过夜。 2) 千燥处理样品组出芽期、全苗期、珠芽期、佛焰茵期、倒苗期样品充分研磨成粉末， 分别称取0.21 g、0.2 g、0.2 g、0.2 g、0.21 g粉末，分别加入3 ml TCA-丙翻提取液，-20 °C 静置过夜。
具体总蛋白提取步骤参考2.2.1
半夏总蛋白溶液处理：
1) 2)
新鲜组样品出芽期、全苗期、珠芽期、佛焰鶴、倒苗期提取的总蛋白溶液分别定容
至 2mL、2mL、2mL、3mL、3mL, -20 T 保存。
千燥处理样品组出芽期、全苗期、珠芽期、佛焰奄期、倒苗期提取的总蛋白溶液分
别 定容至 3mL、2mL、3 ml、3 mL、3 mL, -20 T 保存。 3.2.5不同生长时期半夏总蛋白的SDS-PAGE电泳检教| 参考2.2.2 3.2.6不同生长时期半夏总蛋白的含量測定 参考
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2.2.3 3.3结果与分杴
3.3.1 半夏不同生长期采集的祥品
根据半夏的生长周期’分别于半夏的出芽期、全苗期、珠芽期和彿焰殖期、倒苗期采 样，样品图如下(图3.D。
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