发布时间 : 星期日 文章分子生物学技术实验指导2009版更新完毕开始阅读babcbc9ce109581b6bd97f19227916888586b923
⑨ 生理盐水（0.9%氯化钠溶液）
⑩ 白细胞稀释液：100ml 1%冰醋酸中加10g/L美蓝3滴。 2、 总RNA提取
① DEPC处理水氯仿（分析纯） ② 异丙醇（分析纯） ③ 70%乙醇
④ 异硫氰酸胍变性液 3、 逆转录-聚合酶链反应
a) AMV逆转录酶 b) RNasin(20-40U/ul) c) 随机引物
d) 脱氧核苷三磷酸（dNTP） e) 逆转录缓冲液（5×） f)
Taq DNA聚合酶
g) TNF-α引物 h) PCR缓冲液（10×） i)
MgCl2(25mmol/L)
4、 酶联夹心杂交
a) 亲和素－辣根过氧化物酶结合物 b) 20×SSC c) 包被液 d) 封闭液 e) 2×杂交液 f)
洗液Ⅰ、洗液Ⅱ、洗液Ⅲ
g) 终止液
[实验步骤]
1、人外周血单个核细胞的分离
① 用塑料吸管吸取2ml淋巴细胞分离液加入玻璃试管。
② 取抗凝血1ml，用1ml生理盐水稀释混匀后，用塑料吸管吸取稀释抗凝血沿管壁
缓慢加于淋巴细胞分离液上面（每人2管）。
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③ 将试管置离心机中，室温，2000rpm，20min。
④ 用塑料吸管吸去最上层的血浆，再吸取单个核细胞层，加生理盐水至离管口1cm，
混匀后离心，2000rpm，5min。
⑤ 去上清液，再次加生理盐水0.5ml ，转入1个Eppendorf管中，2000rpm，5min。 ⑥ 留细胞沉淀于Eppendorf管用于下一步的总RNA提取。 2、单个核细胞中总RNA抽提纯化：异硫氰酸胍－酚－氯仿一步法
① 在留有细胞沉淀的Eppendorf管中依次加入500μL变性液、100μL氯仿/异戊醇
(49/1)，置旋涡混合器上混匀，冰浴15min。
② 4℃12000rpm，离心15min。吸取上层水相转入Eppendorf管中，加等体积异丙醇，
-20℃，0.5h。
③ 4℃12000rpm，离心15min，倾去上层异丙醇，加入500μL 70%乙醇进行洗涤。
4℃12000rpm，10min，倒去70%乙醇，留沉淀真空烘干。 ④ 用10μL DEPC处理水溶解RNA，-20℃保存，备逆转录之用。 3、逆转录
① 按下列组成调制反应液：
样品总RNA 5μL AMV逆转录酶 20u 随机引物 100pmol 脱氧核苷三磷酸（每种dNTP各10mmol/L） 2.0μL 逆转录缓冲液（5×） 4μL RNasin(20-40U/ul) 0.5μL DEPC处理水 补至20μL
阴性对照用DEPC处理水代替RNA模板，其余成份相同。将上述反应成份加于0.5ml Eppendorf管，混匀，简短离心。
② 42℃60min。90℃变性5分钟。逆转录产物于4℃保存。 4、PCR扩增
① 按下列组成调制反应液：
cDNA模板 5μL TNF-α引物（25umol/L） 2.0μL 脱氧核苷三磷酸（每种dNTP各2.5mmol/L） 4.0μL
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PCR缓冲液（10×） 5.0μL MgCl2(25mmol/L) 3.0μL 蒸馏的去离子水 补至49μL
以逆转录阴性对照取代cDNA模板作为PCR阴性对照，将上述反应成份加于0.5ml Eppendorf管，混匀，短暂离心，加入30μL石蜡油。
② 扩增: 94℃5min，然后按以下条件进行热循环：94℃45s，56℃30s，72℃30s,循环30次。最后72℃延伸5分钟。
5、酶联夹心杂交检测FGF-αRT-PCR产物
① 用包被液稀释捕获探针，终浓度为500nmol/L，100μL /孔加入到DNA结合微孔板
上，封孔后37℃，1小时。
② 室温下洗液Ⅰ洗3次，洗去未结合的捕获探针。 ③ 加入200μL /孔封闭液， 37℃,30min后弃去。
④ PCR产物变性：取5μL PCR产物用双蒸水作10倍稀释，100℃水浴10min后立即
置冰浴。
⑤ 在DNA结合微孔板内加入49μL稀释的变性PCR产物，50μL 2×杂交液，1μL检
测探针（50μmol/L），混匀后置48℃水浴箱，120 min。
⑥ 弃液后，用48℃预温的洗液Ⅱ洗3次，每次48℃，5min，弃液，拍干。 ⑦ 加入封闭液200μL /孔，37℃，15min后弃去。
⑧ 用封闭液1:1000稀释亲和素－辣根过氧化物酶结合物，100μL /孔加入到微孔板内，
室温,30min。
⑨ 用37℃预温的洗液Ⅲ洗3次,每次37℃, 3min，拍干。
⑩ 加入底物A、B各50μL，混匀后置于暗处显色20min。加入终止液50μL，混匀后
于酶标仪上读取450nm吸光度值。
[注意事项]
1. Eppendorf管(0.5ml)及tip头等需高压灭菌并一次性使用。
2. 用塑料吸管吸取稀释抗凝血加于淋巴细胞分离液上面动作要轻缓，稀释抗凝血与淋巴细胞分离液的体积大致相等。
3. 离心后试管内液面可分为五层，从上到下依次为血浆、单个核细胞、淋巴细胞分离液、粒细胞、红细胞。单个核细胞层为云雾状的白膜。
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4. 抽提总RNA时应小心吸取上层水相转入Eppendorf管，注意勿吸取水相与有机相的界面层，此层含有DNA及蛋白质，这些物质对PCR扩增有影响。
5. 室温低于20℃时，洗液Ⅱ中的SDS易结晶析出，使用前需用温浴使之溶解。 PCR产物过多时，宜将PCR作更大倍数的稀释，变性后再做酶联夹心杂交。
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