发布时间 : 星期日 文章分子生物学技术实验指导2009版更新完毕开始阅读babcbc9ce109581b6bd97f19227916888586b923
实验九 口腔脱落粘膜细胞中基因组DNA的提取
[原理]
利用煮沸法裂解口腔脱落粘膜使得细胞破碎，DNA片段释放，基因组DNA溶解于上清中，可取做PCR反应模板。 [器材]
1、1.5ml离心管 2、微量移液器 3、高速冷冻离心机 4、加热锅 [试剂]
1、PBS（137mmol/L NaCI, 2.7mmol/L KCI, 4.3mmol/L Na2HPO4.7H2O, 1.4mmol/L KH2PO4） 2、TE溶液 [实验步骤]：
1、用棉签刮拭口腔粘膜3-4次，将其放入1.5ml离心管内，加入1 ml缓冲液，反复挤压搅动，使细胞脱落；PBS 2、10000 r/min离心3min；
3、倒掉上清液，沉淀加入100ul TE缓冲液；
4、高速振荡5-10sec，悬浮沉淀，沸水煮10min后冰浴3-5 min； 5、高速振荡5-10sec；10000/min离心3min；
6、取上清液用于扩增反应；4℃保存或冻存剩余DNA。
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实验十 ACE基因的扩增及多态性分析
[原理]
聚合酶链反应（polymerase chain reaction）简称为PCR，是体外DNA扩增反应系统，在这一系统中需：①DNA模板（需扩增的DNA），②一对引物（含20bp的寡核苷酸链，能特异地结合在模板的两端），③底物（四种脱氧核苷三磷酸，dNTPs），④DNA聚合酶（以dNTPs为原料在引物的3′—OH上合成与模板互补的DNA链），⑤反应缓冲系统（适当的pH值，特别需要Mg2+,以激活DNA聚合酶）。其基本原理是：利用碱液并煮沸裂解细胞或病毒，并使蛋白质变性，高速离心后沉淀变性蛋白质并游离DNA，通过94—97℃加热使DNA变性，双螺旋解开形成单链模板，在55℃退火使引物与单链DNA模板结合，72℃延伸在引物的3′—OH上，以dNTPs为原料在DNA聚合酶催化下延伸，合成与模板互补的DNA链。就这样，通过变性—退火—延伸一次循环反应，模板NDA被扩增一倍，若经过35个循环，则模板DNA被扩增235倍，这样大大提高了模板DNA检测的灵敏度，最后通过凝胶电泳检测被扩增的DNA片段。
血管紧张素转换酶(ACE)基因是一种与高血压、肾脏疾病、耐氧能力等有关的一个基因，存在插入／缺失(I／D)两种多态性，经PCR技术扩增后分为三种基因型：纯合子缺失型(DD)，纯合子插入型(Ⅱ)及杂合子插入／缺失型(ID)
[器材]
1、DNA扩增仪
2、高速台式离心机 3、标本裂解仪（或沸水浴） 4、电泳仪 5、平板电泳槽 6、旋涡混匀器 7、紫外分析仪
8、微量进样器（0.5—10μl连续可调） 9、Eppendorf管(0.5ml)及tip头 [试剂]
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1、PCR Kit：
①标本裂解液
②反应液：含DNA引物及dNTP ③Taq DNA聚合酶（1—2u/μl） ④载样缓冲液 ⑤液体石蜡 2、电极缓冲液
3、琼脂糖凝胶（或聚丙烯酰胺凝胶） 4、溴乙锭（1mg/100ml） [实验步骤]
一、PCR
1、 CR反应在20ul反应体系中进行，冰上操作，依次加入
10×缓冲液 2.0ul 2.5uM dNTP 1ul 5umol/L 上下游引物 各1.0ul TaqDNA聚合酶 1U 模板DNA（1ng-1ug） 2.0 ul 加ddH2O至 20ul
2、扩增条件：94℃变性3min，然后与94℃变性40s，58℃退火30s，72℃延伸40s，循环35次后，72℃保持5min，扩增产物4℃保存。 二、电泳鉴定
取5μlPCR扩增产物，与1μl6*载样缓冲液混匀，经1%琼脂糖凝胶（含0.5ug/ml溴电泳30分钟，电压为5V/cm。在紫外灯下观察扩增的DNA片段，鉴定待检标本中基因片段。
分析待测样品的ACE基因的基因分型。
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实验十一 HIF-1α基因的限制性片段长度多态性分析
[原理]
限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，缩写RFLP) 技术的原理是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。因此凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突变（新产生和去除酶切位点）和 一段DNA的重新组织（如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）等均可导致RFLP的产生。
HIF-1α 基因又称为低氧诱导因子-1α (hypoxia-inducible factor-1α)，该基因第7内含子上C958G单核苷酸多态性(SNP)可作为预测低氧训练效果分子遗传学标记设计包含C958G的引物进行PCR，扩增产物片段为325bp，此片段内有两个限制性内切酶TaqI的酶切位点，酶切后产生会产生3个长度片段，即178 bp，97 bp，50 bp。SNP/C958G多态性会破坏了228bp片段上的酶切位点，因此野生型即CC基因型酶切后，产生三片段即；178bp，97bp，50 bp ，突变杂合子即CG基因型酶切后，产生四片段，228 bp，178 bp，97 bp，50 bp，突变纯合子即GG基因型消化后产生两片段，成为228bp和97bp。经过电泳即可鉴定该基因型。
TaqI酶的酶切位点：
5’—TCGA—3’ 3’ —AGCT—5’
[器材]
见实验十、十一 [试剂]
引物是HIF-1α基因C958G的特异引物，其余试剂见实验十、十一 [实验步骤]
一、PCR
1、PCR反应在20ul反应体系中进行，冰上操作，依次加入
10×缓冲液 2.0ul 2.5uM dNTP 1ul 5umol/L 上下游引物 各1.0ul TaqDNA聚合酶 1U
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