发布时间 : 星期一 文章病理科制度及管理规范-二类医疗技术申报附件更新完毕开始阅读cdc64239bb68a98271fefa6b
微波炉抗原修复操作方法:
切片脱蜡至水后，将切片放入盛有抗原修复液（工作液）的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在 92℃～98℃之间并持续 10～15分钟 （注意:无论是使用医用或家用微波炉，请根据具体机型酌情设置条件，务必满足以上步骤中对温度和时间的要求）。取出容器，室温冷却20~30分钟 (注意:不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型)。PBS洗，下接免疫组化染色步骤。
电炉煮沸抗原修复操作方法:
切片脱蜡至水后，放入盛有抗原修复液 (工作液)的容器中，并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸， 从小容器的温度到达92℃~98℃起开始计时15～20分钟，然后端离电炉，室温冷却20～30分钟，蒸馏水冲洗，PBS 洗，下接兔疫组化染色步骤。
二、常用免疫组化染色方法
SP法免疫组化染色
1. 原理：链霉素抗生物素蛋白（SA）是从链霉素中分离出的蛋白质，穿透组织的能力比ABC、PAP复合物大，反应速度快，它含有四个亚基，每个亚基都有与生物素（Biotin）连接的部位，且二者间有极强的亲和力，SA的等电位接近于6.5，近中性，而卵白素（Avidin）为10，因此，SA几乎不与组织中的内源性凝集样物质发生非特异性结合，使用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶放大系统，即可产生低背景、高放大效果。S-P采用生物素标记的第二抗体与链霉素抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及基质素混合液来测定细胞和组织中的抗原。
2. 基本染色方法： （1）石蜡切片脱蜡至水。
（2）3%H202室温孵育5～10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。 （3）蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，(如需采用抗原修复，可在此步后进行)。 （4）5～10%正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1～2小时或4℃过夜。
（5）PBS冲洗，5分钟×3次。
（6）滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10～30分钟; 或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10～30分钟。
（7）PBS冲洗，5分钟×3次。
（8）滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素(PBS稀释)，37℃孵育 10～30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10～30分钟。
（9）PBS冲洗，5分钟×3次。 （10）显色剂显色（DAB或AEC）。 （11）自来水充分冲洗，复染，封片。
（附，冰冻切片免疫组化染色步骤： 冰冻切片4~8um，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3次。用3%过氧化氢孵育5～10分钟，消除内源性
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过氧化物酶的活性。PBS洗，5分钟×2次。下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤）。
免疫组化的方法很多，新方法层出不穷，如Envision二步法，要不断更新，与时俱进。虽然这些方法各有其特色，但总的来说，只要应用恰当均可获得较为满意的结果。方法的选择并不是影响免疫组化结果的主要因素。问题在于一个单位应常规地、固定地使用一种方法，不宜交替使用不同的方法或经常更换方法。一旦选定一种方法，应务必使其标准化，力图使一抗、二抗、标记试剂和底物的浓度、孵育时间和浓度、缓冲液的使用程序化、规范化。
三、免疫组化技术的实用意义
病理诊断常用的仍然是常规石蜡切片HE染色。而免疫组化技术仅仅是一种辅助手段。在免疫组化检测项目的选择方面，病理医师一要结合临床医师的要求，二要满足诊断与鉴别的需要，采取积极、慎重、合理和节约的原则，选择免疫组化项目。不能盲目滥用，以免造成不必要的混乱和加重患者的经济负担。这就要求病理医师对所采用的项目有清楚的了解，明确各项染色结果阳性或阴性对病理诊断有何意义。例如：乳腺癌ER、PR和C-erbB-2检查，对判断肿瘤性质不起决定性作用，但对临床治疗有重要指导意义，应积极开展。实践证明，逐级选择染色项目是行之有效的好方法。即根据日常活检工作中抗体的使用频率及在诊断中的作用，将其分为一线抗体、二线抗体和三线抗体。其中一线抗体是必备的，包括Kertin、Vimentin、LCA、S-100等。但一线抗体仅仅可将肿瘤粗略分类；二线抗体是一线抗体的补充，可将肿瘤更精确地进行分类。如：SMA、Myo、NF、EMA、MBP、GFAP及恶性淋巴瘤免疫功能分类的单克隆抗体等。三线抗体则用于指导临床治疗、病因检测和评估预后。如：ER、PR、C-erbB-2、P53、PCNA及耐药基因等（为满足临床的需要，二、三线抗体也可成为一线抗体）。这样，在免疫组化项目检测中，才能有针对性地、合理地使用这类先进手段。 四、免疫组化试剂的标准化
试剂的标准化，首先要求使用正规免疫试剂公司提供的标准化试剂，并附有详细的试剂说明书，包括：抗体的来源、免疫球蛋白的亚类、单抗或多抗、使用的稀释度、使用流程和注意事项、洗涤时缓冲液的适宜离子浓度和PH值等。即使厂家提供了相应的资料，在使用时亦不能一成不变地生搬硬套。因为厂家提供的标本固定和组织处理等程序可能与应用者实验室的程序不完全相同。 五、免疫组化常用溶液的配制
l、PBS磷酸盐缓冲液（PH7.4）配制： NaCL 8g KCL 0.2g Na2HPO4 1.44g KH2PO4 0.24g
将上述各种试剂溶于800ml水中，用HCL(1N)或NaOH(1N)将pH值调至7.4，加水至1000ml即可。
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2. TBS:
Tris缓冲液配方:(0.5M pH7.6)
Tris(三羟甲基氨基甲烷) 12.1g NaCl 17.5g 浓HCL 约7ml 双蒸水 加至2000ml Tris缓冲液配制方法:
先以少量双蒸水（300~500ml）溶解Tris，加入7mlHCL后，用HCl（IN）或NaOH（IN）将pH调至7.6，最后双蒸水加至2000ml。此液为储备液，4℃冰箱中保存。
TBS配方:
Tris-HCI缓冲液 （0.5M pH7.6） 100mnl NaCI 8.5~9g(0.l5mol/) 双蒸水 加至1000ml TBS配制方法:
先以少量双蒸水溶解NaCl，再加入Tris-HCl缓冲液，最后加双蒸水至1000ml，充分摇匀。
3. 枸椽酸盐缓冲液（Citrate buffer）: 储存液:
0.lM枸橡酸溶液:称取21.0lg柯橡酸（C6H8O7.H2O）溶于1000ml蒸馏水中。 0.lM枸橡酸钠溶液:称取 29.41g枸橡酸钠C6H5Na3O7.2H2O)溶于1000ml蒸馏水中， 工作液:
取9ml A液和4Iml B液加入450ml蒸馏水中，溶液pH值 应为6.0±0.1 4. 胰酶（TrypsIn）: 胰蛋白酶消化液:
取0.05g或0.1g胰蛋白酶加入到100ml0.05%或0.1% PH7.8的无水氯化钙水溶液中，溶解即可。
5.胃酶（Pepsin）——0.4％胃蛋白酶：
胃蛋白酶400mg溶于100ml的0.1N HCL中即可。
6. DAB(3，3-二氨基联苯胺):
6mg DAB溶于l0ml 0.05mol/L TBS（0.05M pH7.6）,再加入0.1ml浓度为3%的H2O2，过滤掉沉淀物，即可。
7. AEC:
4mg AEC溶于1ml二甲基甲酰胺中，加入14ml浓度为0.1M的醋酸缓冲液(PH5.2)，然后加入0.15m1 3%H2O2，过滤掉沉淀物。 六、免疫组化结果的判断
首先应设立阳性和阴性对照，其次，阳性信号的存在部位必须与抗原分布相一致。如：
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T细胞系恶性淋巴瘤组织中，存在着CD20标记阳性的细胞，这是因为瘤组织中散在分布着正常的反应性B细胞系免疫细胞。只有肿瘤细胞阳性才能明确肿瘤的组织来源。需注意的是任何一种特异性标记物并非绝对特异，且敏感性也有一定限度。肿瘤的分化程度和恶变导致的表型改变均影响标记物的表达。多数抗原在组织中的分布是不规则的，即使在成团阳性细胞中，表现也可为强弱不一，甚至其间含有散在或成团的阴性细胞，这些都是正常的。因此，在结果判断有困难或几种免疫组化显示矛盾结论时，应重复染色，不可勉强下结论。染色结束后，应先观察对照组的结果。如阳性对照呈强阳性，阴性对照呈阴性，背景无非特异性染色时，表明本次实验的全部试剂和全过程技术操作准确无误，待检组织中的阳性细胞就是可信的正确结果。
关于阳性的判断标准，目前国际上存在两种以上报告方式，一种是根据阳性细胞的百分比来分级；一种是根据阳性细胞的染色深度来分级；还有将两者结合起来分级的。这需要根据检测项目来区别对待。一般DAB显色阳性应为棕黄色、棕色或棕褐色。而黄色的浅淡背景不应视为阳性。当然，结果的判断还要考虑到固定液、固定方法、抗体的特性、效价、免疫组化方法的敏感性等因素。其他的结果既要与普通病理组织学相结合，又要防止各种主观因素和各取所需的思维影响。 七、免疫组化结果中常见问题的处理
当免疫组化染色没有出现预期结果时，应系统地查找原因，而每一次只能排除一种原因。
对照标本和目标标本均无着色
1. 确认是否漏加了某种试剂，包括一抗、二抗、三抗及底物等。 2. 确认所有的试剂是否按正确的顺序加入，是否孵育了足够的时间。
3. 对照抗体的标签确认是否使用了正确的抗体，以及所用的检测系统是否和一抗匹配，这一点是非常重要的。比如，如果一抗是兔来源的抗体，二抗一定用抗兔的二抗来匹配；或一抗是小鼠的IgM一抗，二抗必须是山羊/兔抗小鼠的IgM（不是IgG）二抗。
4. 检查抗体所使用的稀释度及稀释溶液。
5. 检查抗体的有效和保存条件，尤其是标记了酶或荧光素的抗体，现在大多数试剂公司的抗休均要求在4～8℃条件下保存，应避免反复冻融，试剂保存时一定要避免与挥发性有机溶剂同放一室，以免降低抗体的效价。
6. 查标本的储存条件，最好用巳知阳性的标本来同时做阳性对照。
7. 检查色原/底物溶液，最简单的检测方法是将一滴标记有酶的抗体加入到制备好的底物溶液中，如果底物发生预期的颜色变化，则可排除底物的因素。需要注意的是，有些底物在制成工作液后应在一定时间内用完，否则会失效。
8. 检查冲洗液是否和反应试剂匹配，溶液的pH值很重要，与过氧化物酶底物匹配的溶液中不应含有叠氮钠。
9. 检查复染剂和封片剂是否和所用的色原匹配。 弱阳性
如果阴性对照没有染色而阳性对照标本弱阳性，除了考虑上述因素外还应考虑:
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