发布时间 : 星期五 文章病理科制度及管理规范-二类医疗技术申报附件更新完毕开始阅读cdc64239bb68a98271fefa6b
1. 标本的固定方式，不当的固定方式或固定时温度过高，都会影响到所检测的抗原的数量和质量。
2. 不适当的抗原修复方式，由于石蜡切片在制作的过程中固定剂对抗原的封闭作用，必须用抗原热修复或酶消化或两种同时使用的抗原双暴露法，至于使用哪一种方法，应参照生产厂家的说明，同时结合标本的具体情况而定。
3. 抗体的稀释度是否过高或者孵育的温度，时间是否正确。一般试剂生产厂家都会对试剂给出一定的浓度使用范围，但是由于使用者的标本来自各种组织，处理过程也不尽相同，所以应参照使用范围，对所使用的一抗进行梯度测试，找出最佳的使用浓度。
4. 切片上遗留了过多的冲洗液，当抗体加至切片上时，等于人为地对抗体进行了进一步的稀释。
5. 孵育时切片是否水平放置，否则会导致抗体流失。如果阴性对照没有反应，阳性对照反应良好，而标本弱阳性，则可能是由于阳性对照不是同一种组织、或固定方式不同等原因所致。
6. 除抗体浓度过低，孵育时间过短，试剂超过有效使用期，缓冲液未吸干，造成试剂被稀释，防止切片干燥外，还有复染或衬染太深，室温太低，低于15℃，组织经固定和包埋等处理后抗原丢失严重；虽然环境温度4～20℃，但过度血清蛋白封闭等原因也可影响结果。
7. 染色阴性有操作步骤错误，组织中无抗原，一抗与二抗种属连接错误和试剂失效等原因。 非特异性染色
1. 是否有效地去除了内源性酶和内源性生物素。应注意的是，并不是每一种组织均需要进行此步骤，但对于内源性酶或内源性生物素丰富的组织，如肝脏、肾脏等，需考虑此原因。处埋的方法为:
灭活碱性磷酸酶: 最常用的方法是将左旋咪唑(24mg/ml)加入底物液中，并保持pH值在7.6～8.2，即能除去大部分内源性碱性磷酸酶，对于仍能干扰染色的酸性磷酸酶，可用50mmol/L的酒石酸抑制。
饱和处理内源性生物素: 消除内源性生物素的方法是事先滴加亲和素，以饱和内源性生物素，使之不再有剩余的结合位点。具体方法是在ABC法或SP法染色前将切片浸于25ug/ml亲和素溶液中处理15分钟，PBS清洗15分钟后即可染色。
2. 是否选择使用了正确的封闭血清。电荷吸附所造成的非特异性背景染色消除方法是以二抗动物的非免疫血清，用PBS稀释为3%～10%溶液孵育切片，以封闭吸附位点。有时其它无关蛋白，如牛血清白蛋白也常应用。另外，取材时避开出血、坏死区亦极重要。最近有些国内的实验室应用5%脱脂奶粉替代血清进行抗原封闭，效果也不错。
3. 所选择的抗体是否符合试验要求。因抗原不纯、标本片中含有与靶抗原相似的抗原决定簇等原因造成的非特异件染色，只能通过采用高纯度、高效价的抗体、或针对更具特异性抗原决定簇的单克隆抗体来解决。
4. 一抗的使用浓度是否过高。
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5. 清洗是否充分。应严格操作规程。因在缓冲液中含有一定量的盐，这亦有利于减低背景着色，通常0.05mol/Tris-HCl, 0.l5mol/NaCl巳适用于多数染色方法，溶液内加入吐温-20效果更佳。特殊标记时，试剂公司一般都提供缓冲液的配方。
6. DAB的使用是否正确。DAB的孵育时间和配制方式可以产生某些背景颜色，使用浓缩型DAB试剂盒时，请严格按照说明书标明的滴加顺序操作，注意校正蒸馏水的PH值，以确保实验结果的正确性；粉剂DAB溶解时，常有一些不容性颗粒，这些颗粒须经过滤除去，否则可能沉积于切片组织上，产生斑点状着色。另外，DAB保存不妥产生氧化物亦可沉淀于切片上，因此需将DAB保存于闭光干燥处，现用现配，临用前加H2O2。孵育时间过长也会造成背景染色。
7. 标本染色过程中是否曾经干涸，否则会造成边缘部的非特异性染色。 8. 检查二抗与标本的内源性组织蛋白是否有交叉反应。
9. 另外还有操作过程中冲洗不充分，组织切片折叠，组织中含过氧化物酶未阻断，组织抗原弥散，切片黏附剂过厚，血清蛋白封闭不充分，在室温1小时中超过37℃ 降至室温20～28℃或4℃过夜孵育温度过高等原因。
注意： 1.阳性对照 请注意阳性对照组织上的阳性率。2.冰冻切片免疫组化 只能用丙酮固定。3.热修复 10mM枸橼酸缓冲液PH6.0。4.抗原双暴露 酶消化＋抗原热修复。5.EDTA 1mM EDTA修复液 PH8.0。 八、免疫组化报告
免疫组化报告内容应包括组织固定方法、一抗的标号和种类、免疫组化方法、是否用了附加抗原修复措施和染色结果。不应简单地列出各项结果的阳/阴性。另外，应注意免疫组化报告不应与病理组织学诊断报告分离，而应与特殊染色、组织化学染色报告一样，成为最后病理诊断报告有机的组成部分（可合并到病理诊断报告中）。 九、免疫组化工作程序
1. 初诊医师根据常规HE切片诊断中遇到的问题，提出免疫组化的抗体标记类型，交上级医师核准。
2. 针对诊断难点，及免疫组化标记的抗体种类，并填写免疫组化工作单，交免疫组化技术室。
3. 免疫组化室染好切片后，经质控检查合格（即染色程序无误、对照染色可靠）交给初诊医师。
4. 初诊医师根据免疫组化染色结果，提出初步的诊断，交上级医师复查。 5. 上级医师复查后，发出最后报告，并附上免疫组化结果。 6. 据临床医师提出的免疫组化申请，完成各项检查。 7. 报告发出后，将切片送回免疫组化室归档。 十、免疫组化技术常规
1. 抗体的合理保存：各类抗体有其各自的保存条件，一定要按其说明保存。对每一种新购进的抗体要进行效价测定，并确定最佳稀释度。稀释抗体时，所用的器皿要洁净，防止影响抗体效价。此外，自己稀释的抗体要在短时间内用完。（最好一周内用完，最长
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不宜超过两周：用抗体稀释液，稀释一抗，可保存3个月至一年）
2. 染色前准备
（1）填写申请单：常规外检中需做免疫组化检查的病例，首先由医师将申请单送免疫组化室。
（2）登记：免疫组化室备专门的工作登记本，对所需染色的每一例标本进行登记，以便归档和日后查找。
（3）切片：4um厚，切片放置于60～62℃烤箱烤片2小时。 （4）染色：按常规方法染色（详见染色方法）。 （5）发片：染色后的切片送给初诊医师。
（6）归档：病理医师阅片后，及时将切片送回免疫组化室，统一归档。 十一、 免疫组织化的应用范围
在常规病理诊断中应用免疫组化主要有以下八个方面的意义： 1. 对肿瘤的组织起源进行鉴别分析和确定诊断。 2. 对肿瘤的良、恶性进行综合判断。 3. 发现微小转移灶。
4. 激素受体的检测，以指导临床治疗。 5. 激素类细胞的定性和定位。 6. 指导肿瘤分期。 7. 指导肿瘤预后的判断。 8. 免疫性疾病的辅助诊断。
第四章 病理科常见技术问题及常用特染、试剂配制
一、脱钙问题
一些组织含有钙，含钙的组织不宜直接用石蜡包埋切片。骨组织含钙最多，其它组织也可发生钙化，在组织中形成钙化区。对含钙的组织在组织脱水处理之前应先进行脱钙处理，然后再进行脱水、透明、浸蜡、包埋、切片。用于脱钙的试剂很多，在脱钙剂中没有一种是比较完美的。强酸如硝酸和盐酸可用于密皮质骨的脱钙，在短时间内可除去大量的钙。但需注意这些强酸会损坏组织形态，控制脱钙时间，尤其是骨髓组织。 二、组织切片中的人为现象
在切片染色中出现的一些人为现象可能是由于组织固定不适当，固定剂类型不合适，脱水和浸蜡不够，试剂不适当，切片刀不锋利和切片机性能较差所造成的。经常切片上出现一种细黑色沉淀物与组织无关（例如，沉淀物出现在组织的边缘，组织间隙及血管内）提示形成了福尔马林色素。福尔马林色素用偏光显微镜可以进一步证实。因为这种色素会偏振化一种白光（这种色素在偏光显微镜下看上去象天上的星星），福尔马林色素常见于含血多的组织或尸检组织中。当福尔马林缓冲液耗尽组织变酸时促进一种血红素和福尔马林复合物的形成最终形成福尔马林色素。例如，脾和淋巴结组织特别容易形成这种认为现
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象。
组织块取得比较薄而且用充足的中性福尔马林固定（固定液与组织的比率为10:1）会减少这种人为现象的发生。组织在固定过程中，如果固定液变为深棕色或红色，应该更换新固定液固定。
组织在透明和浸蜡之前脱水不够，组织就会变软，组织在无水乙醇和二甲苯中停留时间过长，组织就会变脆，切片时会出现组织碎裂或空洞等人为现象。组织脱水时间要充分，最终乙醇脱水液的浓度应保持在100%，这在潮湿的天气很难达到100%的浓度，使用空调会减少实验室的湿度。加盖或密封与环境相对隔离对保持乙醇的浓度会有帮助。
虽然乙醇对细胞学涂片固定效果非常好，但是，乙醇容易使组织变脆。结果切片易碎出现“活动百叶窗”现象。
盖玻片下气泡多数情况是由于封固剂太稀，盖玻片下封固剂干后浓缩而形成气泡。封固剂太稠，封片方法不当也容易形成气泡（滴加封固剂后盖玻片应该从一侧轻轻放下，这样封固剂就会慢慢向另一侧散开，避免气泡的形成）。 三、组织处理中的问题
“漂浮物”是小片组织出现在不属于该例标本本身的组织切片上。漂浮物多为组织处理过程中污染而来。例如，取材时取材用具没有彻底清洗就有可能把碎组织带给下一例。因此，每取一例都要彻底清洗取材用具（取材板，刀，剪，手套等），然后再取下一例。取材之前把相同标本分开编号会有助于漂浮物的辨认。例如，有三例前列腺标本，将它们分开加到其它不同的组织标本（胃，肠，子宫）中间。采用这样的方法，如果号码换位，标签写错或者带过去碎组织，那你就会发现一个明显的错误，就会很容易的把带过去的前列腺组织确定为漂浮物。完全相同的组织很难识别出来。如果不用一次性包埋盒，你必须意识到组织有可能带到其它病例中去，问题有可能发生在几天之后，漂浮物来自没有处理干净的脱水盒。引起这样的问题是在包埋时漏掉了小块组织或组织碎片，在清洗时有没有将脱水盒处理干净。再次使用脱水盒时就有可能混入新组织中。漂浮物一般形态保存的很好，因为它们都被蜡处理过。漂浮物是可以识别的，只要能够确信病人标本和容器上的标签与申请单相符，而且病理号始终和组织一起出现。对没有标记的组织不可轻信，错误标记或没有标记的组织有时会引起法律纠纷。
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