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荧光分析
英文名称：fluorescence analysis
定义：利用物质被短波长光激发后产生特征性波长较长的荧光进行定性或定量分析的方法。
包括直接荧光分析法和间接荧光分析法。
荧光分析是指利用某些物质在紫外光照射下产生荧光的特性及其强度进行物质的定性和定量的分析的方法。
荧光分析是指利用某些物质在紫外光照射下产生荧光的特性及其强度进行物质的定性和定量的分析的方法。1852年G.G.斯托克斯(G.G.Strokes)发现荧光，真正的荧光光谱测量则始于本世纪60年代。荧光定量分析常采用直接比较法，将试样与已知物质同时放在紫外光源下，根据它们所发荧光的性质、颜色和强度，鉴定它们是否含有同一荧光物质。某些物质在加入某种试剂后，其产物会产生荧光，也可采用同样方法鉴定。最常用的方法是用荧光分光光度计绘制试样的荧光激发光谱和荧光发射光谱，并与已知物质的这两种光谱进行比较，从而鉴定所含成分。荧光定量分析是先将已知的荧光物质配成不同浓度的标准溶液，用荧光分光光度计测量其在某一波长处的荧光强度并绘制标准曲线，而后再完全相同的条件下测量试样的荧光强度，由标准曲线查出待测物质的含量。70年代以来，荧光分析在仪器、方法和试剂等方面发展非常迅速，在环境监测中有着广泛的应用：借助于有机试剂进行荧光分析的无机元素已达60余种，分析灵敏度可达微克/升级，与原子吸收谱法相近，但光谱干扰少；荧光检测器与液相色谱仪联用，可对有机污染物进行定量分析，如水和废水统一监测方法中多环芳烃的测定及纸层荧光分析法测BaP等。
简史
早在1575年，就有人在阳光下观察到菲律宾紫檀木切片的黄色水溶液呈现极为可爱的天蓝色。1852年G. G. 斯托克斯用分光计观察奎宁和叶绿素溶液时，发现它们所发出的光的波长比入射光的波长稍长，由此判明这种现象是由于这些物质吸收了光能并重新发出不同波长的光线，而不是由于光的漫射作用引起的。斯托克斯称这种光为荧光。这一名词由发生荧光的矿物萤石(fluorite)衍生而来。20世纪50年代前使用滤片式荧光计，只能测量荧光的总光度值。1955年制成第一台荧光光度计。60年代开始了真实荧光光谱、荧光效率和荧光寿命的测量。70年代引进了计算机技术、电视技术、激光技术、显微镜技术。80年代，荧光分光光度计大多配有微型计算机－数据处理器，能对荧光光度值进行积分、微分、除法、减法和平均等运算。
原理
荧光的产生 大多数分子在室温时均处在电子基态的最低振动能级，当物质分子吸收了与它所具有的特征频率相一致的光子时，由原来的能级跃迁至第一电子激发态或第二电子激发态中各个不同振动能级（图1a、图b ）。其后，大多数分子常迅速降落至第一电子激发态的最低振动
荧光分析
能级，在这一过程中它们和周围的同类分子或其他分子撞击而消耗了能量，因而不发射光（图1c）。分子在第一电子激发态的最低振动能级停留约10-9秒之后,直接下降至电子基态的各个不同振动能级，此时以光的形式释放出多余的能量，所发生的光即是荧光(图1d)。某些荧光物质分子在降落到第一电子激发态的最低振动能级后，通过另一次无辐射跃迁降落至亚稳的三重线态，又受到热激活作用再回到第一电子激发态的各个振动能级，最后由第一电子激发态的最低振动能级降落至电子基态而发出荧光。这种荧光因受激发光至发生荧光的时间较长,故称为迟滞荧光（图1e、g、h）。 产生荧光的第一个必要条件是该物质的分子必须具有能吸收激发光的结构，通常是共轭双键结构；第二个条件是该分子必须具有一定程度的荧光效率。所谓荧光效率是荧光物质吸光后所发射的荧光量子数与吸收的激发光的量子数的比值。 荧光光谱和荧光激发光谱 使激发光的波长和强度保持不变，而让荧光物质所发生的荧光通过发射单色器照射于检测器上,调节发射单色器至各种不同波长处,由检测器测出相应的荧光强度，然后以荧光波长为横坐标，以荧光强度为纵坐标作图，即为荧光光谱，又称荧光发射光谱。让不同波长的激发光激发荧光物质使之发生荧光，而让荧光以固定的发射波长照射到检测器上，然后以激发光波长为横坐标，以荧光强度为纵坐标，所绘制的图即为荧光激发光谱，又称激发光谱。 紫外－可见光区荧光的产生，是由第一电子激发态的最低振动能级跃迁至电子基态的各个不同振动能级所致，而与荧光物质分子被激发至哪一个能级无关。因此，荧光光谱的形状与激发光的波长无关。 物质的吸收光谱的第一吸收带的形状，决定于第一激发态的各个振动能级的分布情况。跃迁的两个能级之间的差距越大，吸收峰波长越短。荧光光谱的形状决定于电子基态振动能级的分布情况。电子基态的振动能级越高，两个能级之间的差距越小，则荧光峰的波
长越长。电子基态和第一电子激发态中能级的分布情况是相类似的，所以，荧光光谱和吸收光谱的形状相似，但却呈镜像对称关系。 溶液的荧光强度 溶液的荧光强度与该溶液的吸光强度及荧光物质的荧光效率有关。对于某一荧光物质的稀溶液而言,每一平方厘米的截面上的荧光强度F可用下式表示： 式中φ为荧光物质的荧光效率;I0为每秒钟每平方厘米上入射光的强度；ε为荧光物质的摩尔吸光系数；c为荧光物质的浓度；l为样品池的厚度。由上式可见,在入射光强度与液池厚度不变的条件下，某一荧光物质的稀溶液(εcl≤0.05)的荧光强度与该物质的浓度成正比。
溶液的荧光强度还受到溶剂、溶液温度和pH值的影响。溶液的荧光强度还会因荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用而降低，这种现象称为荧光猝灭。
仪器
进行荧光分析的仪器称为荧光分光光度计。它由以下五部分组成。 光源
荧光分光光度计多采用氙灯作为光源，因它具有从短波紫外线到近红外线的基本上连续的光谱，以及性能稳定、寿命长等优点。近年来激光荧光分析应用日广，它采用激光器作为光
荧光分析
源，有氮激光器、氩离子激光器、可调谐染料激光器和半导体激光器等。染料激光器有连续波和脉冲两大类。 单色器
是从复合光色散出窄波带宽度光束的装置，由狭缝、镜子和色散元件组成。色散元件包括棱镜和光栅。荧光分光光度计有两个单色器：激发单色器和发射单色器。绘制三维荧光光谱（图4 ）时则采用正交多色器。所谓多色器系单色器去掉出射狭缝，正交指两个多色器的入射狭缝互成空间垂直。 试样容器
也称样品池，通常用石英或合成石英制成，玻璃容器因会吸收波长323纳米以下的射线,不适用于 323纳米以下的荧光分析。对于溶液试样的荧光分析，光源、试样容器和探测器通常排成直角形，对于不透明的固体试样，则排成锐角形。 检测器
通常采用光电倍增管作为检测器，灵敏度较高。三维荧光技术则用硅靶增强光导摄象管作检测器。 显示装置
有表头显示、数字显示和记录器等。近年来荧光分光光度计大多配有微处理机，其信号经处理后在荧光屏上显示，并输给记录器记录。某些型号的荧光分光光度计，按下电键即可得出三维荧光光谱。
荧光分光光度计可分为单光束与双光束两种。在单光束荧光分光光度计中，光源发出的光经激发单色器单色化的光只有一束，照射在样品池上，样品发出的荧光经过发射单色器色散后照射在光电倍增管上（图2 ），然后用光度表进行测量。 双光束荧光分光光度计经过激发单色器色散的单色光由旋转镜分为两束，在不同瞬间分别将光会聚于样品池和参比池上。样品溶液和参比溶液发出的荧光进入发射单色器,然后照射在检测器上（图3）。
应用
无机化合物的定量分析 在紫外线照射下能发生荧光的无机物很少，但许多元素与有机试剂所组成的络合物,在紫外线照射下会发生荧光,由其荧光强度和标准曲线可以测定该元素的含量。现在借助于有机试剂进行荧光分析的元素已达60余种。至于非金属元素（如氟、氯、溴、碘、硫等）或过渡金属元素（如铜、铁、钴、镍、汞等）则可用荧光猝灭法进行测定。 荧光分析法的灵敏度很高，一般为微克／升，较紫外-可见分光光度法高二、三个数量级，与原子吸收光谱法相近。如采用激光时间分辨荧光法，灵敏度还可大大提高。例如,测定海水中铀的检出限可达0.04微克/升，测定铕的检出限可达2皮克／升。
有机化合物的定量分析 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，易于吸光，其中庞大而结构复杂的化合物在紫外线照射下都能发生荧光。如采用溶剂萃取、色谱法、电泳等方法预先加以分离而后进行荧光分析，常可测定它们在试样中的低微含量。荧光分析与高效液相色谱法密切结合，已成为该法的检测工具。