大肠杆菌感受态细胞的制备原理、步骤以及重组质粒转化 联系客服

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2、100mmol/ L CaCl2

3.氨苄青霉素溶液(50 毫克/毫升) 4.DNA 连接反应液

5.X-gal 储液(20mg/ml): 用二甲基甲酰胺溶解X-gal 配制成20mg/ml的储液,包以铝箔或黑纸以防止受光照被破坏,储存于-20℃。

6.IPTG储液(200mg/ml): 在800μl蒸馏水中溶解200mg IPTG后,用蒸馏水定容至1ml,用0.22μm滤膜过滤除菌,分装于eppendorf管并储于-20℃。

7.含Amp 的LB 固体培养基:将配好的LB 固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp 储存液,使终浓度为50μg/ml,摇匀后铺板。

8.含X-gal 和IPTG 的筛选培养基:在事先制备好的含50μg/ml Amp的LB 平板表面加40ml X-gal储液和4μlIPTG储液,用无菌玻棒将溶液涂匀,置于37℃下放置3-4 小时,使培养基表面的液体完全被吸收,备用。 四、实验步骤

(一)大肠杆菌感受态细胞制备

1、将受体大肠杆菌接种于LB斜面上活化,置于恒温培养箱中37℃培养过夜。

2、取一环上述大肠杆菌培养物菌落接种于3 毫升LB试管中,于恒温振荡器上,37℃振荡培养过夜(约16 小时),必要时在显微镜下镜检菌细胞是否形态一致,有无杂菌污染。 3、用移液管无菌条件下,取过夜培养液1 毫升,接种于新鲜的LB 中(100毫升LB/250毫升三角瓶,接种量按菌液浓度而定,一般在1%左右),于恒温振荡器上37℃培养2―3 小时。

4、取1 毫升培养液以未接种的LB 作空白对照,在751 分光光度计上测OD550 的光密度值,约为0.2―0.5 左右。

5.无菌条件下将上述1 毫升菌液倒入1.5毫升EP 离心管中(离心管应带盖并高压灭菌过),每组2 支。

6、带菌液的离心管置于冰上10 分钟,冷却菌液,平衡好,置于台式低速离心机上,3500r/min 离心5 分钟。

7、无菌条件下,倒去上清LB,倒斜离心管,让LB 流干,留下沉淀菌体,加入预冷的100mmol/L CaCl2溶液600微升,用微量取样器轻轻吸冲底部沉淀菌体,使其悬浮后,把2支管转为1支,摇匀后于冰浴中放置30分钟。

8、重新将CaCl2 菌悬浮液置于台式低速离心机上,3500r/min离心10分钟,小心侧倒掉上清CaCl2 ,留沉淀菌体。

9、再把菌体悬浮在200 微升100mmol/L CaCl2 的溶液中,置于冰上作为转化的受体菌液。此制备的感受态细胞应在此步后1小时至24小时内使用,效率比较高。

10.在事先制备好的含50μg/ml Amp的LB 平板表面加40ml X-gal 储液和4μlIPTG储液,用无菌玻棒将溶液涂匀,置于37℃下放置3-4小时,使培养基表面的液体完全被吸收,备用。 (二)重组DNA 转化

1.取0.2ml 大肠杆菌感受态细胞,在无菌条件下,加入到连接液的Eppendorf管,混匀,置冰浴中30 分钟。

2.冰浴后,将正在转化反应的细胞悬浮液加入已调好42℃的的恒温水浴槽内,保温2分种。 3.热冲击处理后的细胞易死亡,应迅速倒入LB培养液1 毫升,(无抗菌素LB 液,有助于基因表达)马上置37℃水浴1 小时,每10 分钟翻转1 次。

4.用移液器取0.1 毫升的转化菌液直接涂布含50μg/ml Amp、40ml X-gal储液和4μlIPTG 储液LB 固体平皿上,共涂布三个培养皿。

5.用移液器取未经转化的受体大肠杆菌感受态菌液0.1毫升直接涂布于含50μg/mlAmp、40ml X-gal 储液和4μlIPTG 储液LB 固体平皿上,作为受体菌对照。

6.将第14、15 步涂布培养皿先放室温15 分钟左右,使涂布上的菌液干燥不会流动。然后倒置放于恒温箱中37℃培养过夜。

7.第二天取出培养皿,观察对照平皿和转化平皿菌落情况。对照平皿因受体菌对Amp 敏感,故不能在含Amp的培养基上生长。转化平皿是否有兰色和白色菌落生成?如果长出兰色菌落,说明自连的载体pUC18质粒

已转入受体菌,但目的基因没有接入载体。如果长出白色菌落,说明目的基因已接入载体,重组质粒的转化子因此丧失了β-半乳糖苷酶活性,在x-gal 和ITPG 存在的生色诱导培养基上只能形成白色菌落。 五、结果和讨论

比较对照平皿和转化平皿,讨论转化成败原因.