发布时间 : 星期三 文章大肠杆菌感受态细胞的制备原理、步骤以及重组质粒转化更新完毕开始阅读d31d15765acfa1c7aa00cc58
2、100mmol/ L CaCl2
3.氨苄青霉素溶液（50 毫克/毫升） 4.DNA 连接反应液
5.X-gal 储液(20mg/ml): 用二甲基甲酰胺溶解X-gal 配制成20mg/ml的储液,包以铝箔或黑纸以防止受光照被破坏,储存于-20℃。
6.IPTG储液(200mg/ml): 在800μl蒸馏水中溶解200mg IPTG后,用蒸馏水定容至1ml,用0.22μm滤膜过滤除菌，分装于eppendorf管并储于-20℃。
7.含Amp 的LB 固体培养基:将配好的LB 固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp 储存液,使终浓度为50μg/ml,摇匀后铺板。
8.含X-gal 和IPTG 的筛选培养基：在事先制备好的含50μg/ml Amp的LB 平板表面加40ml X-gal储液和4μlIPTG储液,用无菌玻棒将溶液涂匀,置于37℃下放置3-4 小时,使培养基表面的液体完全被吸收，备用。 四、实验步骤
（一）大肠杆菌感受态细胞制备
1、将受体大肠杆菌接种于LB斜面上活化，置于恒温培养箱中37℃培养过夜。
2、取一环上述大肠杆菌培养物菌落接种于3 毫升LB试管中，于恒温振荡器上，37℃振荡培养过夜（约16 小时），必要时在显微镜下镜检菌细胞是否形态一致，有无杂菌污染。 3、用移液管无菌条件下，取过夜培养液1 毫升，接种于新鲜的LB 中（100毫升LB/250毫升三角瓶，接种量按菌液浓度而定，一般在1%左右），于恒温振荡器上37℃培养2―3 小时。
4、取1 毫升培养液以未接种的LB 作空白对照，在751 分光光度计上测OD550 的光密度值，约为0.2―0.5 左右。
5.无菌条件下将上述1 毫升菌液倒入1.5毫升EP 离心管中（离心管应带盖并高压灭菌过），每组2 支。
6、带菌液的离心管置于冰上10 分钟，冷却菌液，平衡好，置于台式低速离心机上，3500r/min 离心5 分钟。
7、无菌条件下，倒去上清LB，倒斜离心管，让LB 流干，留下沉淀菌体，加入预冷的100mmol/L CaCl2溶液600微升，用微量取样器轻轻吸冲底部沉淀菌体，使其悬浮后，把2支管转为1支，摇匀后于冰浴中放置30分钟。
8、重新将CaCl2 菌悬浮液置于台式低速离心机上，3500r/min离心10分钟，小心侧倒掉上清CaCl2 ，留沉淀菌体。
9、再把菌体悬浮在200 微升100mmol/L CaCl2 的溶液中，置于冰上作为转化的受体菌液。此制备的感受态细胞应在此步后1小时至24小时内使用，效率比较高。
10.在事先制备好的含50μg/ml Amp的LB 平板表面加40ml X-gal 储液和4μlIPTG储液,用无菌玻棒将溶液涂匀,置于37℃下放置3-4小时,使培养基表面的液体完全被吸收，备用。 （二）重组DNA 转化
1.取0.2ml 大肠杆菌感受态细胞，在无菌条件下，加入到连接液的Eppendorf管，混匀，置冰浴中30 分钟。
2.冰浴后，将正在转化反应的细胞悬浮液加入已调好42℃的的恒温水浴槽内，保温2分种。 3.热冲击处理后的细胞易死亡，应迅速倒入LB培养液1 毫升，（无抗菌素LB 液，有助于基因表达）马上置37℃水浴1 小时，每10 分钟翻转1 次。
4.用移液器取0.1 毫升的转化菌液直接涂布含50μg/ml Amp、40ml X-gal储液和4μlIPTG 储液LB 固体平皿上，共涂布三个培养皿。
5.用移液器取未经转化的受体大肠杆菌感受态菌液0.1毫升直接涂布于含50μg/mlAmp、40ml X-gal 储液和4μlIPTG 储液LB 固体平皿上，作为受体菌对照。
6.将第14、15 步涂布培养皿先放室温15 分钟左右，使涂布上的菌液干燥不会流动。然后倒置放于恒温箱中37℃培养过夜。
7.第二天取出培养皿，观察对照平皿和转化平皿菌落情况。对照平皿因受体菌对Amp 敏感，故不能在含Amp的培养基上生长。转化平皿是否有兰色和白色菌落生成？如果长出兰色菌落，说明自连的载体pUC18质粒
已转入受体菌，但目的基因没有接入载体。如果长出白色菌落，说明目的基因已接入载体，重组质粒的转化子因此丧失了β-半乳糖苷酶活性,在x-gal 和ITPG 存在的生色诱导培养基上只能形成白色菌落。 五、结果和讨论
比较对照平皿和转化平皿，讨论转化成败原因.