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植物内生真菌HDF-I-008发酵活性产物的分离
xx，xx
（xx大学生命科学学院2004级生物制药）
摘 要：本试验尝试用大孔吸附树脂对该活性物质进行富集和分离，以得到一定纯度的活性物质，确定出较为合理的分离纯化工艺路线和条件。通过分离纯化实验，筛选出适合吸附植物内生真菌HDF-I-008所产活性物质的大孔吸附树脂X-5。不同浓度的乙醇溶液的洗脱实验表明，50%的乙醇溶液可以有效地将活性物质从树脂柱上洗脱，但对其组成及结构尚需进一步研究。
关键字：内生真菌；大孔吸附树脂；分离纯化
Isolation of active production from endophytic fungi HDF-I-008
xx，xx
(xxx Unversity, institute of life sciences, biological pharmaceutics in 2004)
Abstract: This experiment tries to employ macroporous adsorbent resin for enrichment and separation of the active substances, in order to get a certain purity substances and identify more reasonable routes and conditions of separation and purification. The research of purification of the endophytic fungus HDF-I-008 active substance appeared that resin X-5 is the best adsorbent. The different density of ethanol solution elution experiments show that 50% ethanol solution may elute effectively active substances from the X-5 resin column. However, we need further study its compositions and structures.
Key words: endophytic fungi; macroporous adsorbent resin; isolation and purification
内生真菌(endophytic fungi)是指生活在植物体内或在其生活史的一定阶段处于植物体内的一类真菌[1]。近年来研究表明，内生真菌通常会产生与其宿主植物相同或相似的生理活性物质，在宿主的生长发育和系统演化过程中起重要的作用。真菌产生的生物活性物质存在极大的多样性(如抗肿瘤、抗病毒、抗细菌、抗真菌、抗虫等物质)，而利用植物内生真菌来研究开发生物农药，是解决化学农药问题的有效途径之一。植物内生真菌能够产生功能特殊的次生代谢产物，是新化合物新药物的潜在资源，它们在医药、工业、农业等领域具有重要的应用前景。
目前，用大孔树脂提取水溶性活性产物的方法多有报道[2]，其现己广泛应用于天然植物中活性成分的提取分离。由于大孔吸附树脂对吸附具有选择性，因此吸附现象在科学技术与工业生产的许多方面具有重要的应用价值。例如，通过选择性吸附，可以实现复杂物质体系的分离与各种成分的纯化:通过专一性吸附可以实现对复杂体系中某种物质的检测；目前，我国吸附分离功能高分子材料的研究、生产、应用己形成一个较好的体系，新的品种不断出现，应用领域不断扩展[3]
。大孔树脂对生物化学制品的吸附分离都有良好的效果。在处理工业废水方面也有成功的应用。
现今对植物内生菌活性物质的分离技术主要有：溶剂萃取法，膜分离技术，盐析沉淀法和离子交换法。本实验尝试用大孔吸附树脂对植物内生菌的代谢活性物质进行富集和分离，以便确定出较为合理的分离纯化工艺路线和条件。
1 材料
1.1供试菌种
菌株HDF-I-008：由柏树中分离得到的一株具有抑菌活性的内生真菌。 指示菌株:HDB-Ⅱ-003， HDB-Ⅱ-005 （为白蚁肠道内具有分解纤维素能力的内生细菌，由黑龙江大学生命科学学院分离并保存） 1.2培养基
查氏培养基：蔗糖30g，NaN03 2.0g，KCl O.5g，MgS04 O.5g，FeS04 O.O1g，K2HP04 1.0g，蒸馏水1000ml，pH自然，固体培养基加入2％的琼脂。
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，蒸馏水1000ml，pH7.0-7.2，固体培养基加入2％的琼脂，半固体培养基加入0.6％的琼脂装入20ml/50ml三角瓶中。
2 方法
2.1菌种发酵培养 (1) 孢子斜面培养：无菌操作环境下，以划线法将孢子接种于固体斜面培养基上，28℃培养4-5天，等孢子长丰满，呈深绿色，放入冰箱，于4℃下保藏。
(2) 孢子斜面活化：将保藏的真菌斜面在无菌操作环境下，以划线法将孢子接种于固体斜面培养基上，28℃培养4-5天，等孢子长丰满，呈深绿色时按上述方法再转接于固体斜面培养基上，28℃培养72h。
(3) 发酵培养：将活化后的斜面用接种环接两环于己灭菌的液体培养基中，装液量为200mL/500mL三角瓶置于28℃的摇床上，在220rpm转速下培养10-11d。 (4) 指示菌活化：将保藏的指示菌用接种环转接于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，28℃培养24h。
(5) 指示菌菌悬液配置：预先把指示菌在室温下活化2h，然后在超净台上用接种环刮取两环菌种置于30mL无菌水中，摇匀，制成菌悬液。 2.2 活性测定方法
运用琼脂扩散法进行抗菌活性菌株的筛选。琼脂扩散法主要用于定性测定活性物质体外抗菌效力，包括滤纸片扩散法、琼脂挖块法和牛津杯法等，其原理都是利用抗菌活性物质在琼脂中扩散，使其周围指示菌的正常生长受到抑制，从而形成抑菌圈。根据抑菌圈的有无可以判定发酵液中是否含有抗菌活性物质；根据抑菌圈的大小可以判定指示菌对该发酵液中抗菌活性物质的敏感程度。 2.3 牛津杯法检测抗菌活性
在每个PDA平板上4个角点处（距培养皿边缘约10mm）轻放4个牛津杯，置于4℃冰箱30min（利用牛津杯的重力自动在培养基上下沉、密封，防止发酵液外溢）。4个牛津杯中分别用移液枪加入待测样150μL，置于4℃冰箱8～10h，等发酵液基本吸收后，将平板放于28℃培养36h。观察牛津杯四周有无抑菌圈，有抑菌圈的测量其抑菌圈直径，并做相应记录。 2.4 发酵液的预处理
发酵液5，000r/min离心15min除菌。 2.5 发酵液稳定性实验
2.5.1 发酵液中活性物质的酸碱稳定性实验
取预处理后的发酵液30mL，平均分成6份，分别用4%的NaOH，HCl溶液调节其pH值为1，3，5，7，10，12，静置1h，然后调其pH至5，取处理样测其剩
余活性。
2.5.2 发酵液中活性物质的热稳定性实验
取预处理后的发酵液30mL，平均分成4份，分别置于室温（25℃），50℃，70℃，90℃四个温度下处理30min，取处理样测其剩余活性。
3 大孔吸附树脂对树木内生菌活性物质的分离
3.1 树脂的预处理[4]
工业级新树脂使用前必须进行预处理，以除去树脂中含有的少量低聚物、有机物及有害离子。
(1)装柱前清洗吸附柱，以防有害物质对树脂的污染，并排净柱内的水。 (2)用2BV乙醇或甲醇，以2BV/h的流速通过树脂层，并浸泡4-5h.
(3)用乙醇或甲醇，以2BV/h的流速通过树脂层，洗至流出液加水不呈白色混浊
为止，并用蒸馏水以同样的流速洗净乙醇或甲醇。
(4)用2BV的5%HCl溶液，以4-6BV/h的流速通过树脂层，并浸泡2-4h，然后用
蒸馏水以同样流速洗至流出液pH为中性。
(5)用2BV的2%NaOH溶液，以4-6BV/h的流速通过树脂层，并浸泡2-4h，然后用蒸馏水以同样流速洗至流出液pH为中性。 3.2 大孔吸附树脂的筛选
取经过预处理的大孔吸附树脂D4020，X-5，NKA各2g，放入三角瓶中，加入50mL预处理的发酵液，室温下置于220rpm的摇床上静态吸附4h，取吸附剩余液测其活性。
3.3 X-5树脂最佳吸附pH的选择
每个三角瓶中放入经过预处理的X-5树脂2g，发酵液50mL，调节pH值分别为4，5，6，7室温下置于220rpm的摇床上吸附处理2h，取吸附残液，测其活性。 3.4 X-5树脂吸附速率曲线
取经过预处理的X-5树脂2g，加入预处理的发酵液50mL，室温下置于220rpm的摇床上进行静态吸附，在第5，15，30，45，60min以及以后每隔30min分次取出吸附残余液，测其活性。
3.5 X-5树脂解析时洗脱剂的选择
分别取经过预处理的X-5树脂1g放入三角瓶中，加入预处理的发酵液25mL，室温下置于220rpm的摇床上进行静态吸附2h，饱和后过滤，加入50mL解吸剂，分别为甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇、丙酮、50%丙酮，于室温下置于220rpm的摇床上静态解吸5h，旋蒸至干，加水至5mL，然后测定洗脱液的活性。 3.6 不同浓度的甲醇、乙醇溶液洗脱能力的比较
分别配制不同浓度的甲醇、乙醇溶液，浓度分别为10%，30%，50%，70%，90%，100%。分别处理0.5g吸附饱和的X-5树脂，洗脱液用量为50mL，室温下220rpm摇床上静态解吸5h，然后旋蒸至干，加水至5mL，做生测，检测其洗脱能力。 3.7 pH值对50%乙醇洗脱能力的影响
取饱和树脂2mL，分别加入50mL己经调节pH为3，4，5，6，7，8的50%乙醇溶液50mL，室温下置于220rpm的摇床上静态解吸5h，旋蒸至干，加水至5mL测其活性。
3.8 抗菌活性物质的动态吸附及结晶
X-5树脂经过预处理后装柱(2.0cm×30cm)，发酵液用量1，800mL，以流速4mL/min进行吸附。吸附完毕后，先用去离子水500mL洗脱，然后再用50%的甲醇
500mL洗脱，最后用50%乙醇500mL洗脱，流速均为4mL/min，收集洗脱液，每50mL为一瓶。分别测定每瓶洗脱液的抗菌活性，合并活性高的洗脱液，将合并液旋蒸浓缩后于20℃下静置48h，得到粗结晶。 3.9 结晶物质的活性测定
取少量粗结晶，加入少量水，使其完全溶解，然后检测其生物活性。用同pH值的无菌蒸馏水作对照。
4结果与分析
4.1发酵液中活性物质的酸碱稳定性实验
本实验主要是考察发酵液中活性物质的酸碱稳定性，为以后实验条件的探索奠定一定的基础。
由图4-1可以看出，在室温下，活性物质在pH为中性的条件下活性较好，较为稳定，随着pH值的升高或者降低，活性均呈现下降的趋势，发酵液酸性或碱性越强，活性也就越低，并且对碱性环境更加敏感。
100相对活性（%）8060402000246PH 值8101214
图4-1 pH 值对活性的影响
4.2发酵液中活性物质的热稳定性实验
本实验主要是考察发酵液中活性物质的热稳定性，为以后实验条件的探索奠定一定的基础。
实验结果如图4-2所示，经过30min的处理后，随温度的升高，活性物质的活性随之降低的幅度很小。经过90℃处理后的发酵液的活性下降非常不明显。这说明随温度的升高，发酵液的活性略有下降，但温度不会对发酵液中的活性成分的生物活性产生显著的影响，所以在以后的实验中可以不用考虑温度对实验结果的影响。