发布时间 : 星期一 文章PCR和RT-PCR技术更新完毕开始阅读d4be143201f69e31433294f8
CFLP? techmology Desalted
引物产量受合成化学的效率及纯化方法的影响。Invitrogen?以一个最小OD单位确保总寡核苷的产量（表7）。定制引物以干粉形式运输。最好在TE重溶引物，使其最终浓度为100μM。TE比去离子水好，因为水的pH经常偏酸，会引起寡核苷的水解。
表7. 各种纯化方法的最低寡核苷酸产量
Number of Bases 大于20 Synthesis Scale 50nmole 200nmole 1μmol 10μmol 大于等于20 50nmole 200nmole 1μmol 10μmol Minimum Yield(OD) for Different Primer Purities* Standard/Desalted 2 8 20 200 5 20 50 500 Cartridge 2 8 20 NA 2 10 25 NA HPLC NA 3 10 100 NA 3 15 150 PAGE NA 1 3 30 NA 1 5 50 Note:For primers > 50 bases, PAGE purification is recommended and HPLC is not an option. NA is not available.
*These Yields are seen with the following 5' modifications: biotin, fluorescein(FITC), rhodamine, primary amines(NH2), phosphate(PO4), HEX, TET, FAM, and
phosphorothioates(S-Oligos), Other modifications may have slightly lower yields.
引物的稳定性依赖于储存条件。应将干粉和溶解的引物储存在-20℃。以大于10μM浓度溶于TE的引物在-20℃可以稳定保存6个月，但在室温（15℃到30℃）仅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室温（15℃到30℃）最多可以保存2个月。
热启动
热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。尽管Taq DNA聚合酶的最佳延伸温度在72℃，聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进行PCR反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时，如定点突变、表达克隆或用于DNA工程的遗传元件的构建和操作，热启动PCR尤为有效。
限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反应液，并将其置于预热的PCR仪。这种方法简单便宜，但并不能完全抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。
热启动通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度。包括延缓加入Taq DNA聚合酶在内的大部分手工热启动方法十分烦琐，尤其是对高通量应用。其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分，如镁离子或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。在热循环时，因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。象手动热启动方法一样，蜡防护层法比较烦琐，易于污
染，不适用于于高通量应用。
Platinum DNA聚合酶对于自动热启动PCR来说方便高效（图20）。Platinum Taq DNA聚合酶的成分为复合有抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体的重组Taq DNA聚合酶。抗体在PCR配制以及在室温的延时保温过程中抑制酶的活性。Taq DNA聚合酶在变性步骤的94℃保温过程中被释放到反应中，恢复了完全的聚合酶活性。同经化学修饰用于热启动的Taq DNA聚合酶相比，Platinum酶不需要在94℃延时保温（10到15分钟）以激活聚合酶。使用Platinum Taq DNA聚合酶，在94℃进行2分钟就可以恢复90％的Taq DNA聚合酶活性。
图20. 使用Platinum? Taq DNA聚合酶增加特异性
A组. 人基因组DNA内克隆的HIV DNA的检测。带有HIV gag区域的1000个质粒DNA拷贝同100ng的基因组DNA混合，使用gag区域的引物进行扩增。泳道1. 使用Taq DNA聚合酶，在室温配制反应液。泳道2. 使用Taq DNA聚合酶，通过在94℃加入酶而手工热启动。泳道3. 使用Platinum Taq DNA聚合酶，在室温配制反应液。B组. 由100ng人基因组DNA扩增4.1kb的人β-球蛋白。泳道1. 使用Taq DNA聚合酶，在室温配制反应液。泳道2. 使用Taq DNA聚合酶，在冰上配制反应液并放置在预热（80℃）的PCR仪。泳道3. 使用Platinum Taq DNA聚合酶，在室温配制反应液。
镁离子浓度
镁离子影响PCR的多个方面，如DNA聚合酶的活性，这会影响产量；再如引物退火，这会影响特异性。dNTP和模板同镁离子结合，降低了酶活性所需要的游离镁离子的量。最佳的镁离子浓度对于不同的引物对和模板都不同，但是包含200μM dNTP的典型PCR起始浓度是1.5mM（注意：对实时定量PCR，使用3到5mM带有荧光探针的镁离子溶液）。较高的游离镁离子浓度可以增加产量，但也会增加非特异性扩增，降低忠实性。为了确定最佳浓度，从1mM到3mM，以0.5mM递增，进行镁离子滴定。为减少对镁离子优化的依赖，可以使用Platinum Taq DNA聚合酶。Platinum Taq DNA聚合酶能够在比Taq DNA聚合酶更广的镁离子浓度范围内保持功能，因此仅需较少的优化（图21）。
图21. 使用Platinum? Taq DNA聚合酶拓宽镁离子浓度范围
由100ng人基因组DNA扩增人β-球蛋白基因的2.8kb区域。A组，使用Taq DNA聚合酶，在冰上配制反应液并放置在预热（80℃）的PCR仪。B组，使用Platinum Taq DNA聚合酶，在室温配制反应液。
促进PCR的添加剂
退火温度，引物设计和镁离子浓度的优化足以对大多数模板进行高特异性的扩增，但是，某些模板，包括高GC含量的模板，需要其他的措施。影响DNA熔解温度的添加剂提供了提高产物特异性和产量的另外一种方法（图22）。为获得最好的结果需要模板的完全变性。另外，二级结构会阻止引物结合和酶的延伸。PCR添加剂，包括甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱以及PCRx Enhancer Solution可以增强扩增。它们可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。PCRx Solution还有其他优点。在同Platinum Taq DNA聚合酶（图22）和Platinum Pfx DNA聚合酶一起使用时，基本上不需要优化镁离子浓度。这样，将Platinum技术同添加剂结合，增强了特异性，同时减少了第三种方法-镁离子优化的依赖。为获得最佳结果，应优化添加剂的浓度（图23），尤其是会抑制Taq DNA聚合酶的DMSO，甲酰胺和甘油。
巢式PCR
图22. 使用PCRx Enhancer Solution提高特异性
使用Platinum? Taq DNA聚合酶，由100ng人基因组DNA扩增一条156bp的片段（GC含量62％）。使用标准PCR缓冲液（A组）或带有1×PCRx Enhancer Solution的PCRx Amplificaton Buufer（B组），测试不同的MgCl2浓度（泳道1到4分别为1.0，1.5，2.0，2.5mM）。循环在94℃ 30秒，60℃ 30秒，68℃ 1分钟进行35个循环。
图23. 测试PCRx Enhancer Solution的不同浓度
在带有不同量PCRx Enhancer Solution（0到4×）的1×PCRx Amplificaton Buufer中，使用Platinum? Taq DNA聚合酶，对包含三核苷重复的149bp序列（GC含量78％）进行扩增。