发布时间 : 星期六 文章PCR和RT-PCR技术更新完毕开始阅读d4be143201f69e31433294f8
使用巢式引物进行连续多轮扩增可以提高特异性和灵敏度。第一轮是15到20个循环的标准扩增。将一小部分起始扩增产物稀释100到1000倍加入到第二轮扩增中进行15到20个循环。或者，也可以通过凝胶纯化将起始扩增产物进行大小选择。在第二轮扩增中使用一套巢式引物，其可以同第一套引物内侧的靶序列结合。巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同两套引物都互补的靶序列很少。而使用同样的引物对进行总数相同的循环（30到40）会扩增非特异性靶位点。巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5' RACE）的特异性。
增加PCR灵敏度 模板质量
模板的质量会影响产量。DNA样品中发现有多种污染物会抑制PCR。一些在标准基因组DNA制备中使用的试剂，如SDS，在浓度低至0.01％时就会抑制扩增反应。分离基因组DNA较新的方法包括了DNAZol，一种胍去垢剂裂解液，以及FTA Gene Guard System，其可以同基质结合，在血液及其他生物样品中纯化贮存DNA（表8）。
表8. 基因组DNA分离方法 Method Proteinase K/phenol extraction DNAzol? Reagents Description Classic method Fast, phenol-free DNA isolation
模板浓度
起始模板的量对于获得高产量很重要。对大多数扩增满意，104到106个起始目的分子就足以在溴化乙锭染色胶上观察到。所需的最佳模板量取决于基因组的大小（表9）。举例说，100ng到1μg的人类基因组DNA，相当于3×104到3×105个分子，对于足以检测到单拷贝基因的PCR产物。质粒DNA比较小，因此加入到PCR中的DNA的量是pg级的。
表9. 基因组大小和分子数目的比例 Genonic DNA E. coli Saccharomyces cerevisiae Size(bp)* 4.7×10^6 2.0×10^7 Target Molecules/μg of Amount of DNA(μg) for Genomic DNA 1.8×10^8 4.5×10^7 1.3×10^7 -10^5 Molecules 0.001 0.01 0.01 Arabidopsis thaliana 7.0×10^7 Drosophila melanogaster Homo sapiens Xenopus laevis 1.0Mus musculus Zea mays *Haploid genome size 1.6×10^8 2.8×10^9 2.9×10^9 3.3×10^9 1.5×10^10 6.6×10^5 3.2×10^5 3.1×10^5 2.7×10^5 6.0×10^4 3.4×10^11 0.5 1.0 1.0 1.0 2.0 1×10^(-6) pUC 18 plasmid DNA 2.69×10^3
酶的选择
除了使用高质量模板DNA，聚合酶的选择也会影响产量。Platinum聚合酶比其他聚合酶产量高，因为它防止了PCR反应配制过程中的非特异性扩增（图24）。对长片段（最大到12kb）的高灵敏度PCR，应选择酶混合物，最好是Platinum形式，如Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity。这种酶结合了Platinum技术和酶混合物（Taq DNA聚合酶同带有校正功能的聚合酶混合物）的优点。
提高PCR的忠实性 带有校正功能的酶
包括克隆和效率分析，PCR产物表达或定点突变在内的PCR应用都需要高忠实性的PCR。Taq DNA聚合酶被看做是低忠实性的聚合酶，因为其缺少3'到5'外切核酸酶（校正）活性。使用带有3'到5'外切核酸酶活性的热稳定聚合酶可以提高忠实性。但是这些聚合酶的产量比Taq DNA聚合酶低。Platinum Pfx DNA聚合酶明显比Taq DNA聚合酶忠实性高，而且带有Platinum产品产量和特异性高的优点（图25）。
图25. Platinum? Pfx Taq DNA聚合酶的高灵敏度和特异性
使用人thrombospondin的1.1kb片段的探针对基因组DNA（泳道1到6分别为100，50，10，5，1
和0ng）扩增35个循环。A组，使用1单位Platinum Pfx Taq DNA聚合酶，在室温配制反应液。B组，使用2.5单PfuTurbo? DNA聚合酶，在冰上配制反应液。C组，使用1单位Taq DNA聚合酶，在冰上配制反应液。
酶混合物
将Taq DNA聚合酶同带有3'到5'外切核酸酶活性第二种聚合酶混合在一起可以获得比单独Taq DNA聚合酶高的忠实性，并可以得到高产量及扩增长模板。Gibco BRL高保真酶混合物，Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity忠实性是单独Taq DNA聚合酶的6倍，并可以最高扩增到12kb。
其他参数
除了酶，高浓度的dNTP或镁离子会降低忠实性。将dNTP的浓度从200μM降低到25-50μM可以增加精确度。如果四种核苷的浓度不同，忠实性会受影响。进行较少的PCR循环也会有助于增加忠实性，因为增加循环数目和产物长度就会增加突变可能性。 PCR需要注意的一些问题 扩增长目的片段
当扩增大于5kb的目的片段时，可以使用用于超长PCR的酶或酶混合物以获得最佳产量（图24）。Taq DNA聚合酶并不能有效扩增较长目的片段（大于5kb），可能是因为其缺少3'-5'外切核酸酶活性，不能纠正dNTP错误掺入。错误配对的延伸几率大大降低，减少了较长产物的产量。将Taq DNA聚合酶同带有3'-5'外切核酸酶活性的热稳定DNA聚合酶混合，可以扩增最高为30kb的目的片段。Platunum Pfx DNA聚合酶（带有3'-5'外切核酸酶活性）也可以扩增较长产物（≤12kb）。
除了选用正确的热稳定DNA聚合酶，较长产物的扩增还需要改变标准步骤的延伸时间、变性时间、缓冲液pH。按1分钟/kb增加延伸时间使聚合酶完成合成。一般对于有效的超长PCR，延伸温度会低至68℃。因为延伸时间较长，对于20kb的模板高达20分钟，所有使用较高起始pH的缓冲液。如果pH将至低于pH7.0，DNA会脱嘌呤。为了防止模板损伤，在每个循环将94℃变性时间减少到30秒或更短，将在扩增前温度增加到94℃变性温度的时间限制为小于等于1分钟。引物使用标准方法所使用的同样的方法设计，使用18到24个碱基得到较好的产量。
防止残余（Carry-over）污染
PCR易受污染的影响，因为它是一种敏感的扩增技术。小量的外源DNA污染可以与目的模板一块被扩增。当前一次扩增产物用来进行新的扩增反应时，会发生共同来源的污染。这称之为残余污染。从其他样品中纯化的DNA或克隆的DNA也会是污染源。
可以在PCR过程中使用良好的实验步骤减少残余污染。使用抗气雾剂移液管的阻止气雾剂进入eppendorf管内。为PCR样品配制和扩增后分析设计隔离的区域，在准备新反应前更换手套。总是使用不含有模板的阴性对照检测污染。使用预先混合的反应成分，而不是每个反应的每个试剂单独加入。
一种防止残余污染的方法是使用尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）。这种酶（也称为尿嘧啶-N-糖基化酶或UNG）
移除DNA中的尿嘧啶。在扩增过程中将脱氧尿嘧啶替换为胸腺嘧啶使得可以把前面的扩增产物同模板DNA区分开来。因为前面的扩增产物对UDG敏感，所有可以在PCR前对新配制的反应用UDG处理以破坏残余产物。
PCR产物纯化
残余反应成分包括抑制克隆，测序和标记反应的引物，核苷和热稳定聚合酶。因此，一般在进一步操作之前需要纯化PCR产物。包括多次酚：氯仿抽提及随后的PEG沉淀或异丙醇沉淀的纯化步骤虽然有效，但是耗费时间，且会丢失产物。Maligen Rapid PCR Purification System在10分钟内从反应成分中纯化PCR产物。它对80bp到10kb很大范围的PCR片段都有效，有效回收95％的原有样品（图26）。
图26. 扩增后PCR片段的纯化 使用1.2μg引物（泳道1）或3.5μg引物（泳道2）。峰值包含约1μg扩增产物的完整PCR体系。引物36到40碱基长。将峰值反应纯化，对纯化前（泳道A）和纯化后
（泳道B）的洗脱液
水相使用琼脂糖凝胶电泳分析。
部分PCR产物可能需要通过凝胶电泳，和影响克隆和测序的非特异性PCR产物分离纯化出来。使用Maligen Gel Extraction System将目的产物从琼脂糖中纯化出来，这是一种基于硅土的，从凝胶中快速纯化DNA片段的技术。
PCR产物克隆
PCR克隆主要有TA克隆法, 限制性酶切与连接法，杂交法和近期开发出来的特异性重组法等。 但因为TA克隆法操作最简单，快速和高效的原因，成为Taq聚合酶PCR产物的最佳克隆方法。TA克隆法由Invitrogen发明，并拥有全球TA Cloning商标的专利权。
TA克隆方法（Original TA Cloning Kit）
利用Taq聚合酶同时具有的末端连接酶的功能，在每条PCR扩增产物的3`端自动添加一个3`-A突出端。Invitrogen公司TA克隆系统和Topo TA克隆系统都提供一个线性含3`-T突出端的载