发布时间 : 星期日 文章江苏省新沂市高中生物第一章无菌操作技术实践1.1微生物的实验室培养一教案(选修1)更新完毕开始阅读d660049db5daa58da0116c175f0e7cd1842518a4
域，在这里操作，可以避免杂菌污染。 疑难解析 1．接种时注意事项： (1)对接种所用的器具及用品要彻底消毒灭菌，在脑子里要建立起“有菌”的观念。 (2)接种始终都要在无菌条件下进行(酒精灯火焰附近构成无菌区)。不能随意说话、谈笑。 (3)接种画线时要注意： ①画线的方向应该从里往外。 ②线条要细且密。 ③不要重复画线。 2．无菌技术： (1)概念： (2)消毒与灭菌： 接种与培养大肠杆菌在第一个实验的基础上，用学生配制好的培养基进行接种实验。教师可用课件配合本实验进行实验的演示，帮助学生理解接种的无菌操作过程，也可以请学生演示，大家讨论操作的规范性。尤其要注意接种过程的无菌操作。 课后： 完成课外作业及下一节预习提布置课外作业及下一节预习提纲。 纲。 板书 设计 教学 札记
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三、其他补充教学资料（各位教师根据各班教学特点选择补充资料，可另附纸）
2．实验操作
2．1 计算：根据配方比例，计算100mL培养基各成分用量。
2．2 称量：准确称取各成分。称取牛肉膏和蛋白胨时动作要迅速，目的是防止牛肉膏吸收空气中水分。
2．3 溶化：①加水加热熔化牛肉膏；②加入蛋白胨和氯化钠继续加热；③加入琼脂；④用蒸馏水定容到100mL。整个过程不断用玻棒搅拌，目的是防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。
2．4 调pH：用1mol/LNaOH溶液调节pH至偏碱性。
2．5 灭菌：将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加塞包扎后用高压蒸汽灭菌锅灭菌；所用培养皿用报纸包扎后用干热灭菌箱灭菌。
2．6 倒平板：待培养基冷却至50℃左右时在酒精灯火焰附近操作进行。
其过程是：
①在火焰旁右手拿锥形瓶，左手拔出棉塞； ②右手拿锥形瓶，使锥形瓶的瓶口迅速通过火焰；
③左手将培养皿打开一条缝隙，右手将培养基倒入培养皿，立刻盖上皿盖。
④待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置。
〖思考1〗锥形瓶的瓶口通过火焰的目的是消灭瓶口的杂菌，防止杂菌感染培养基。 〖思考2〗倒平板的目的是防止培养基冷却过程中形成的水滴落到培养基表面。 〖思考3〗若皿盖和皿底之间粘有培养基，则该平板能否培养微生物？为什么？ 不能。空气中杂菌会在这些粘附培养基上繁殖，并污染皿内培养基。
〖思考4〗配制斜面培养基中，试管要加塞棉塞的目的是保持通气并防止杂菌感染。 〖思考5〗试管培养基形成斜面的作用是增大接种面积。 2．7 接种
2．7．1微生物接种的最常用方法是平板划线法和稀释涂布法，另外还有穿刺接种和斜面接种等。
2．7．2平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。其操作步骤是：
①将接种环在酒精灯火焰上灼烧直至烧红。
②在酒精灯火焰旁冷却接种环，并打开大肠杆菌的菌种试管的棉塞。 ③将菌种试管口通过火焰达到消灭试管口杂菌的目的。 ④将冷却的接种环伸入到菌液中取出一环菌种。 ⑤将菌种试管口再次通过火焰后塞上棉塞。
⑥将皿盖打开一条缝隙，把接种环伸入平板内划3～5条平行线，盖上皿盖，不要划破培养基。
⑦灼烧接种环，冷却后从第一区划线末端开始向第二区域内划线。重复上述过程，完成三、四、五区域内划线。注意不要将第五区的划线与第一区划线相连。
⑧将平板倒置放在培养箱中培养。
〖思考6〗取菌种前灼烧接种环的目的是消灭接种环上的微生物；除第一次划线外，其余划线前都要灼烧接种环的目的是消灭接种环上残留菌种；取菌种和划线前都要求接种环冷却后进行，其目的是防止高温杀死菌种；最后灼烧接种环的目的是防止细菌污染环境和操作者。
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〖思考7〗在第1次划线后都从上次划线末端开始的目的是获得由单个细菌形成的标准菌落。
2．7．3 稀释涂布平板法：将菌液进行一系列梯度稀释，并将不同稀释度菌液分别涂布到琼脂固体培养基上进行培养。当稀释倍数足够高时，即可获得单个细菌形成的标准菌落。
2．7．4 系列稀释操作：
①取盛有9mL水的无菌试管6支，编号101、102、103、104、105、106。
②用灼烧冷却的移液管吸取1mL菌液注入编号为101试管中，并吹打3次，使之混匀。 ③从101倍液中吸取1mL菌液注入到编号为102试管内吹打均匀，获得102倍液。依此类推。
〖思考8〗操作中试管口和移液管应在离火焰1～2cm处。整个操作过程中使用了1支移液管。
3．实验操作——大肠杆菌的培养与纯化： (1)平板划线法： 通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落(colony)。 ①平板划线操作：
a．将接种环放在火焰上燃烧，直到接种环烧红。 b．在火焰旁冷却接种环，并打开棉塞。 c．将试管口通过火焰。
d．将已冷却的接种环伸入菌液中，沾取一环菌液。 e．将试管口通过火焰，并塞上棉塞。
f．左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种 的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上 皿盖，注意不要划破培养基。
g．灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线 的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在 三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线 与第一区相连。 h．将平板倒置，放入培养箱中培养。 ②问题讨论：
a． 为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环?在划线操作结束时，仍然需
要灼烧接种环吗?为什么?
提示：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
b．在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线? 提示：以免接种环温度太高，杀死菌种。
b． 在做第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线? 提示：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，
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能使细菌的 数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
(2)稀释平板法和涂抹平板法： 将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀 释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进 行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的 微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面 形成单个的菌落。 ①稀释平板操作(如下图)：
a．将分别盛有9 mL水的6支试管灭菌，并按 10叫～10叫的顺序编号。
b．用无菌移液管吸取1 mL培养的菌液，注入 第二支试管中。取另一支无菌移液管，用手指轻压 移液管上的橡皮头，吹吸三次，使菌液与水充分 混匀。 c．从10倍稀释的试管中吸取1 mL稀释液，注入10。倍稀释的试管中，重复第2步的操作。依次类推，直到完成最后一支试管的稀释。
提示：移液管需要经过灭菌。操作时，试管口和移液管应在离火焰1～2 cm处。 ②涂抹平板操作：
a．将涂布器末端浸在盛有体积分数为70％的酒精的烧杯中。取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃。
b．操作中一定要注意防火!不要将过热的涂布器放在盛放酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精。
(3)培养：将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放人37~C恒温箱中，培养12 h和24 h，分析观察并记录结果。
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