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MicroPulser电穿孔仪操作手册
2018年12月27日
1、 介绍 （1）基本原理
MicroPulser电穿孔仪用于细菌、酵母和其他众多微生物的电击转化，转化时，高压电
脉冲作用于悬浮在小体积高阻介质中的样品。本系统由一个脉冲发生器（pulse generator）模块、一个电击腔（shocking chamber）和一个装有电极的电击杯（cuvette）组成。样本放置于电击杯的电极之间。MicroPulser模块包含一个电容器，将电容器充电至高电压，然后模块将电容器中的电流放电到试管中的样品中。
MicroPulser的电容放电电路产生具有指数衰减波形的电脉冲，如下图。当电容器放电
至样品时，跨越电极的电压迅速上升至最大电压（or峰值电压，peak voltage；也称为初始电压，Vo），并随时间（t）减小，如下式：
其中τ=R·C，为时间常数，是脉冲长度的简便表达式。 R为电路电阻，单位为ohms（欧姆）。 C为电容，单位为microfarad（微法拉）。
根据方程1，τ是电压下降至峰值电压1/e（~37%）的时间。MicroPulser的内部电
路被设计以使E.coli、酿酒酵母及其他许多微生物可以得到最佳电穿孔，最佳转化效率发生
在大约5ms的时间常数内。这些电穿孔条件是通过使用10微法拉电容器和将600欧姆电阻与样品池并联以及将30欧姆电阻与样品池串联来实现的。
除时间常数外，电场强度是另一个决定转化效率的重要参数。电场强度E，是施加于电
极间的电压，公式为：
其中，V为施加的电压，d为电极间的距离，单位为cm。电场强度和细胞的尺寸（size）
决定了横贯每个细胞的电压降，正是电压降可能是电穿孔中电压效应的重要表现。
30欧姆串联电阻的目的是在发生电弧的情况下保护设备电路。在正常操作条件下，当
样本在高电阻介质中，电阻不会影响施加在样本上的电压。但是，当样本的电阻较低时，电阻将极大地降低施加在样品上的电压。施加在样品上的电压的分压降（fractional drop）由下式得到：
当Rsample为600欧姆，对于样品就会有5%的电压降（30/（30+600）=0.048）。
基于这个原因，当样品溶液的电阻低于600欧姆时，不应进行电穿孔试验。这包括培养基未彻底从细胞中去除的样本，残留有NaCl的DNA样本或连接混合物。MicroPulser能够测量样本的电阻，若样本介质电阻过低则不会进行操作。
（2）仪器参数操作（Manipulation of instrument parameters）
MicroPulser仪器的一些参数可以进行设置以达到最大转化效率，包括场强E，时间常数τ，截断指数衰减脉冲的宽度。场强的设置可以有两种方式进行操作。一是，介于200-3000V电压可以直接在仪器上设置，这是最容易控制的。改变电压而保持其他条件不变是大多数电穿孔优化程序的基础。第二，使用不同电极间隙宽度的电转杯也是改变场强的一种方法。对于微生物的电穿孔，0.1和0.2cm间隙的电转杯最常被使用。E.coli的电穿孔当使用0.1cm电转杯时通常使用1.8kV电压（E=18kV/cm），而使用0.2cm电转杯时使用2.5kV电压（E=12.5kV/cm）。这些电穿孔条件作为预设程序内置于MicroPulser中，分别位于细菌设置菜单中的Ec1（V=1.8kV）和Ec2（V=2.5kV）。另外，细菌设备菜单中的第三个程序Ec3的电压为3.0kV（当电转杯为0.2cm时E=15kV/cm），我们发现可以得到比2.5kV更高的转化效率。
时间常数可以通过改变样品的电阻而改变。样品电阻的改变可以通过两种方式。一是，增加电穿孔介质的盐浓度或缓冲浓度会降低样品的电导，反之亦然，结果导致时间常数的改变。第二，电转杯中样品体积与样品电阻呈反比，降低样品体积会增加样品电导。样品体积对电导的影响在低电阻介质中是最显著的。这些影响因素将会在后面部分进一步介绍。
MicroPulser还包括一种在电压大于600V时比预期时间常数更快截断指数衰减脉冲的方法。当脉冲被MicroPulser终止时，电压只在样品上作用指定长度的时间，可能在1.0 ~ 4.0 ms之间。下图显示了这种波形和真正的指数衰减脉冲的差异。
2、 影响电穿孔的因素
通过多年的研究，证实了微生物电穿孔的电条件（see Chang, et al., 1992, and Nickoloff, 1995, for overviews as well as for protocols on electroporation of numerous species）。对大多数微生物而言，最佳电转化发生在与E.coli和酿酒酵母所使用的电转化条件相似的条件下，E.coli和酿酒酵母是当今研究中最常使用的两个物种。对于E.coli的电穿孔，文献报道最常使用的条件是0.2cm电转杯，40μl细胞样本，电压2.5kV，时间~5ms。对酿酒酵母，报告中最常使用的条件是0.2cm电转杯，40μl细胞样品，1.5kV电压和时间常数~5ms。对许多细菌而言，如沙门氏菌属（Salmonella）、假单胞菌属（Pseudomonas）、幽门螺杆菌（Helicobacter）、包柔式螺旋体属（Borrelia）、链球菌属（Streptococcus）、乳球菌属（Lactococcus）和肠球菌属（Enterococcus），电穿孔条件与E.coli一样。而对于其他的细菌，改变电场强度可以得到更高的电转化效率。一个相似的案例可见于其他种属的酵母。
MicroPulser的设计可以精确施加E.coli和酿酒酵母获得最佳转化效率所需的脉冲参数。当使用高阻样本时，时间常数被设置为5ms。对于这些微生物，MicroPulser预先设定了在0.1或0.2 cm的电击杯中电穿孔大肠杆菌，或在0.2或0.4 cm的电击杯中电穿孔酿酒酵母时输送正确电压的程序。 （1） 细胞生长（Cell Growth）
对于大多数细菌而言，在对数生长期的早期或中期收获细胞，可以得到最高的转化效率。对于E.coli，当细胞进行稳定期，转化效率剧烈下降（Dower，1990）。相反，大多数酵母通常在对数生长的中期至晚期收获细胞。对于酿酒酵母（S.cerevisiae），对数生长晚期的培养物相比早期的培养物，转化效率提高了60倍（Becker and Guarente，1991）。获取细胞的最佳生长期通常随细胞种类而异。当制备一种新的物种的感受态细胞时，最好使用为同种属而制定的程序。对所需考虑因素的建议和常用的制备感受态细胞的方法在Dower et al（1992）和Trevors et al（1992）的文章中被详细讨论。 （2） DNA
大多数的电穿孔应用是将质粒DNA转入细胞中，需要提及的是，几乎任何形式的分子都可以通过电穿孔被导入细胞中，包括DNA、蛋白、糖类、小分子等。除了少数例外，当导入自主复制质粒时，使用超螺旋质粒进行电穿孔可以提高转化效率。但是，将整合入宿主基因组的质粒当使用线性化质粒时，转化效率较高。例如，假丝酵母、毕赤酵母和四膜虫使用线性质粒比超螺旋质粒效率更高。
在E.coli和单核细胞增多性李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）电穿孔转化时，使用松弛型环状质粒（relaxed circular plasmid）仅比使用超螺旋质粒的转化效率略低（Leonardo and Sedivy，1990，Park and Stewart，1990）。但是，在E.coli和Streptococcus pyogenes（酿脓链球菌）的电穿孔转化时，线性质粒比环状质粒的转化